Angiopep-2修饰的脑靶向基因传递载体的研究

【摘要】随着分子生物学的发展与科学技术的进步，基因治疗逐渐成为各种中枢神经系统疾病的新型治疗方法。如何跨越血脑屏障，将治疗基因有效递送到脑中病变部位，是一个亟待解决的关键问题。安全性好、转染效率高且不受体内环境干扰，能有效通过血脑屏障，理想的脑靶向基因传递载体必须同时满足上述要求。本课题将PEI/DNA复合物与脂质体联合使用，制备得到脂质体、PEI、DNA的三元复合物，并在复合物上连接PEG和脑靶向肽Angiopep-2，使复合物具有脑靶向的功能。首先对制备PEI/DNA复合物的相关影响因素（制备溶剂PH、离子强度、制备温度、复合比例等）进行系统考察，通过对复合物粒径、表面电位等理化性质研究，确定了得到较小粒径PEI/DNA复合物的制备条件，即室温下、溶剂PH在3～7、离子强度小于0.02mol/L、PEI与DNA复合比例（N/P）为4～10。随后选择在基本符合上述条件的三种溶剂体系中制备PEI/DNA复合物，MTT法检测复合物的细胞毒性，并用pGL-3质粒评价复合物在Hela细胞中的转染效率，最终确定了以去离子水作为溶剂、N/P为8的条件下制备PEI/DNA复合物。在此基础上，将脂质体加入PEI/DNA形成三元复合物，以期降低PEI的毒性。通过对复合物的粒径、表面电位、细胞毒性及转染效率的检测，可制备得到粒径小于200nm、电位20mV左右的pCaLip/PEI/DNA三元复合物，该复合物具有较高的转染效率和良好的安全性，且在10%血清存在条件下其转染效率不受影响。随后进一步将脑靶向肽Angiopep-2与PEG化的磷脂共价连接，经核磁共振确证连接。制备脑靶向三元复合物，粒径、电位分别为180nm、15mv。MTT法检测其具有较好的安全性，细胞存活率90%以上。细胞转染结果表明，靶向复合物与未经靶向修饰的复合物相比，在阳性细胞hCMEC/D3和C6细胞中的转染显著提高（P<0.05），而在阴性细胞Hela中无明显变化。建立人大脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3）BBB细胞模型，并在该模型上考察三元复合物的血脑屏障透过性。结果表明本文制备的脑靶向三元复合物能够有效促进质粒透过血脑屏障细胞模型。用上述脑靶向三元复合物携载TRAIL质粒考察其对BBB模型下层C6细胞的杀伤作用，结果显示与未经靶向修饰的载体组相比其具有更显著的肿瘤细胞杀伤效果。综上所述，本文成功制备了Angiopep-2修饰的脂质体/PEI/DNA三元复合基因传递载体，体外研究表明该载体具有较好的安全性和较高的转染效率，能够成功透过血脑屏障模型，是一种有潜力的脑靶向基因传递载体。
【作者】刘林霞；
【导师】陈妍；
【作者基本信息】吉林大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】脑靶向；Angiopep-2；PEI；脂质体；基因传递；

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