过表达Bmstat对家蚕细胞增殖及转录模式的影响

【摘要】JAK/STAT信号通路是一条多种细胞因子共同作用的信号传导途径，其相关蛋白及基本功能在生物体中相对保守，为了解家蚕中JAK-STAT通路对细胞增殖的影响，构建了过表达stat的转基因载体pIZT-STAT。将pIZT-STAT转基因载体转染家蚕BmN细胞，通过Zecon连续筛选三个月后，获得稳定转化细胞。并分别通过MTT、流式细胞仪等检测稳定转化细胞增殖情况；利用高通量转录组测序技术（RNA-Seq）研究过表达BmSTAT的稳定转化细胞和正常BmN细胞的转录组学。实验结果发现过表达BmSTAT后，细胞增殖速度加快，与发育相关基因出现上调。对过表达BmSTAT基因的稳定转化细胞和正常BmN细胞的比较转录组学研究发现：正常家蚕细胞中共有10853个基因表达，以家蚕ActinA3基因表达水平为参照，发现在家蚕细胞中log2(Foldchange)＞2的高表达基因有41个，这些基因的产物主要涉及蛋白合成、天然免疫、信号转到、环境适应；在转化细胞中共有10129基因表达。Foldchange（FC）达到显著性的差异表达基因（即只在一个样本中表达的差异基因）共252个，表达上调的基因123个，下调基因129个；T-test达到显著性的差异表达基因（二个样品均表达的差异表达基因）共800个，其中表达上调的基因787个。WEGO分析结果显示，表达上调基因主要集中在细胞、细胞组分、大分子复合物、代谢进程、细胞进程、催化活性、结合等。通过KEGG通路分析发现，在碳代谢、氨基酸的合成、氧化磷酸化、嘌呤代谢、嘧啶代谢、剪接体、核糖体、RNA转运、核糖体的合成、蛋白质在内质网的加工、转录、翻译、细胞的周期和凋亡等富集了大量的过表达基因。与Ras、Rap1、MAPK、Wnt、Hippo、JAK/STAT、FoXo、Ca2+、PI3-AKt、mTOR等信号途径相关的基因也出现了许多基因上调，同时发现在细胞周期的调控信号通路中也出现了11个上调的基因。同时测到下调基因有13个，WEGO分析显示与细胞，细胞组分，代谢过程，obsoletemolecularfunction，细胞进程，催化活性，转运蛋白活性有关。KEGG通路分析发现，这些基因涉及氧化磷酸化，甲烷代谢。表明JAK-STAT信号通路在调节细胞的生长发育、增殖过程中起着重要作用。将过表达BmSTAT稳定转化细胞与正常BmN细胞分别感染BmCPV经裂解的多角体病毒BmCPV。分别在2天和6天用westernblotting检测VP7的表达水平，发现稳定转化细胞和正常细胞之间对BmCPV感染没有显著差异。说明家蚕JAK/STAT信号通路对BmCPV增殖没有影响。
【作者】王健；
【导师】薛仁宇；贡成良；
【作者基本信息】苏州大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】BmSTAT；过表达；细胞周期；RNA-seq；差异表达；FC-检验；T-检验；BmCPV；

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