磺酰化乳糖基神经酰胺影响人肝癌细胞整合素αV的分子机制研究

【摘要】脑苷脂(cerebroside)为细胞膜上的一类脂质分子,具有重要的生物学作用。CST(cerebrosidesulfotransferase)是一种脑苷脂磺酰基转移酶,首先由K.Honke等从人的肾癌细胞中纯化而来。CST主要催化活性硫酸分子即硫酸3’磷酸腺苷5’磷酸硫酸(3’-phospho-adenosine-5’-phosphosullfate,PAPS)的磺酰基到脑苷脂的半乳糖3位羟基上,催化的产物为磺酰化脑苷脂,包括磺酰化乳糖基神经酰胺(Sulfatedlactosylceramide,Sulfo-Lacto-Cer或SM3)和磺酰化半乳糖基神经酰胺(galactosylcermidesulfate,SM4),但是在肝癌细胞主要为Sulfo-Lacto-Cer。CS基因主要位于染色体22q12.2,这个基因长度22kb,包括8个外显子,其中6个是编码的,2个是非编码的,编码的蛋白由423个氨基酸残基组成,位于高尔基体上,是Ⅱ型跨膜蛋白,具有2个潜在的N糖基化位点,是磺酰化的脑苷脂合成过程中的一个终末限速酶。本实验室以前的研究表明脑苷脂磺酰基转移酶CST基因催化的产物与肿瘤的转移有关,CST在高转移肿瘤细胞中高表达,在低转移肿瘤细胞中低表达,而且磺酰化脑苷脂可以与一些和肿瘤细胞转移有重要关系的黏附分子相结合,如整合素、中肾细胞因子、血栓素和肝细胞生长因子等。以前的结果也证实CST催化产生磺酰化的脑苷脂可以促进肝癌细胞对层粘连蛋白和玻连蛋白的黏附性,从而促进肝癌细胞的转移。另外本实验室以前研究还发现和CST高度同源的磺酰基转移酶半乳糖：3-O-磺酰基转移酶-2(Gal:3-O-sulfotransferase-2,Ga13ST-2)及其催化产物sulfo-Lewisx能够通过影响整合素的表达来参与肝癌细胞的转移。磺酰化修饰是否在肿瘤转移中起一个特异性的作用,CST及其外源合成的磺酰化乳糖基神经酰胺是如何影响肿瘤转移的还不清楚,因此,在以前的研究基础上,主要探讨CST的催化产物磺酰化乳糖基神经酰胺对整合素aV亚基表达的影响及其可能的分子机制。研究分为以下两部分。第一部分整合素αV亚基的表达受乳糖基神经酰胺的磺酰化调节我们将外源性的磺酰化乳糖基神经酰胺和乳糖基神经酰胺加入肝癌SMMC-7721细胞培养基中,观察处理后的细胞对细胞外基质如玻连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、胶原的黏附能力,发现磺酰化乳糖基神经酰胺的处理可以促进肝癌SMMC-7721细胞与这些细胞外基质的黏附能力。这些细胞外基质蛋白的结合配体是整合素,其中细胞外基质玻连蛋白是整合素αV亚基的配体,在肿瘤血管生长中起重要的作用,与肿瘤的关系十分密切,我们因此检测乳糖基神经酰胺的磺酰化对整合素αV亚基影响。首先在肝癌SMMC-7721细胞中加入外源性的磺酰化乳糖基神经酰胺及其前体乳糖基神经酰胺作为对照,RT-PCR和Westernblotting结果发现,磺酰化的乳糖基神经酰胺处理细胞可以明显的上调整合素aV亚基的表达,而其前体乳糖基神经酰胺则没有这种效应,并且外源性的磺酰化乳糖基神经酰胺对整合素αV亚基的调节具有明显的时间和剂量依赖性,在2μmol/L的浓度下作用24小时,整合素αV亚基的表达已显著上调。磺酰化乳糖基神经酰胺的分子有了一个酸性基团,使分子变成带有负电荷,可以改变分子与其它配体的亲和力,为了排除电荷的影响,我们将带有相似负电荷的外源性糖脂ManNpropanylperac和cyclo-ManNpropanylperac作为对照,结果表明仅磺酰化的乳糖基神经酰胺促进整合素αV亚基的表达,其它外源性糖脂ManNpropanylperac和cyclo-ManNpropanylperac均无类似性的作用。这说明外源性的磺酰化乳糖基神经酰胺上调整合素aV亚基的表达并非仅仅是由于负电荷的作用。那么内源性的磺酰化糖脂可否促进整合素αV亚基的表达呢?我们接着分别在CST过表达稳转SMMC-7721细胞株CSTl和CST8,以及CST干扰稳转SMMC-7721细胞株Chp2和Chp5中检测整合素αV亚基的表达,发现CST过表达时高表达整合素aV亚基,CST被干扰时则低表达整合素αV亚基。这说明无论是外源性的磺酰化乳糖基神经酰胺,还是CST催化产生的内源性的磺酰化乳糖基神经酰胺都可以上调整合素αV亚基的表达,这种磺酰化修饰的糖链可能在肿瘤转移过程中起着重要的作用。第二部分Sulfo-Lacto-Cer通过Spl转录因子促进整合素αV亚基的表达转录因子是调节细胞内mRNA表达的一个重要作用因子,可以通过转录因子本身的表达量或者活性的改变来调控靶基因。为了进一步探讨磺酰化乳糖基神经酰胺上调整合素αV亚基的机制,我们通过生物信息学对整合素αV亚基的启动子区域进行分析,整合素aV亚基启动子区域有多个转录因子结合位点,包括转录因子Spl,Sp3v1,Sp3v2,ETS,Egr1,Egr2和AP2等,通过realtime-PCR检测外源性磺酰化乳糖基神经酰胺对这些转录因子的作用,结果发现,Spl转录因子的表达水平显著升高,而其它转录因子则无改变或改变不显著。我们猜测Spl转录因子可能是磺酰化修饰和整合素αV亚基之间的一座桥梁。我们将外源性Sulfo-Lacto-Cer、Lacto-Cer、ManNpropanylperac和cyclo-ManNpropanylperac加入SMMC-7721细胞培养液中,发现Sulfo-Lacto-Cer能够促进Spl转录因子的mRNA和蛋白水平的表达,其它对照寡糖化合物则没有这种影响。外源性的Sulfo-Lacto-Cer可以上调Spl转录因子的表达,那么内源性的磺酰化修饰是否有同样的作用?接着检测了CST过表达及CST干扰稳转细胞株中Spl转录因子的表达情况,结果显示,在CST过表达细胞株中Spl转录因子高表达,而在CST干扰细胞株中Spl转录因子则低表达。说明内源性的磺酰化乳糖基神经酰胺也可以上调Spl转录因子的表达。磺酰化乳糖基神经酰胺既可以上调整合素aV亚基的表达,也可以上调Spl转录因子的表达,磺酰化乳糖基神经酰胺是否是通过Spl转录因子对整合素aV亚基起作用呢?为此我们构建了Spl转录因子过表达质粒pcDNA3.0-Sp1和Spl转录因子干扰质粒Si-Spl,将pcDNA3.0-Sp1转染到CST干扰稳转细胞中,检测整合素aV亚基的表达,发现转染pcDNA3.0-Sp1的细胞上调了整合素aV亚基的表达；Si-Sp1转染到CST过表达稳转细胞中,整合素aV亚基的表达则被抑制；Si-Sp1转染到SMMC-7721细胞,同时加入外源性的磺酰化乳糖基神经酰胺,发现Spl转录因子被干扰后外源性的磺酰化乳糖基神经酰胺则不能诱导整合素aV亚基的表达。这说明磺酰化乳糖基神经酰胺的作用确实与Spl转录因子相关。整合素aV亚基的启动子区富含GC区,是SPl的潜在结合位点,我们通过构建整合素aV亚基启动子区域包含Spl转录因子结合位点的片段来检测其对整合素aV亚基启动子活性的影响,发现Spl转录因子可以正调控整合素aV亚基的启动子活性,磺酰化的乳糖基神经酰胺则促进Spl转录因子上调整合素aV亚基的启动子活性。磺酰化的乳糖基神经酰胺是否促进Spl转录因子直接结合到整合素aV亚基的启动子区域,从而上调整合素aV亚基的表达呢?我们分别通过EMSA实验和ChIP实验进一步验证,发现Spl转录因子是可以直接结合到整合素aV亚基的启动子区域,同时磺酰化的乳糖基神经酰胺可以促进这种结合。
【作者】吴伟；
【导师】吴兴中；
【作者基本信息】复旦大学，生物化学与分子生物学，2011，博士
【关键词】脑苷脂磺酰基转移酶；磺酰化乳糖基神经酰胺；整合素αV亚基；Sp1转录因子；

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