基于RNAi技术获得高含量支链淀粉且抗低温糖化的转基因马铃薯品种

【摘要】马铃薯(SolanumtuberosumL.)是生产淀粉的重要原料,也是一种优良作物。马铃薯淀粉中支链淀粉含量为80%左右。在很多应用领域中,要求淀粉具有较低的糊化温度和抗老化能力,高纯度的支链淀粉就具有这样的特性,但马铃薯淀粉中仍有20%的直链淀粉,去除直链淀粉需要耗费大量能源。马铃薯通常储存于4-10℃低温条件下,目的是防止马铃薯发芽或染病腐烂,以满足长时间提供工业用途和食用的需求。然而马铃薯在低温储藏过程中会发生低温糖化现象,使淀粉降解成还原糖,从而使马铃薯的淀粉含量下降,严重影响后续加工。如果用还原糖含量高的马铃薯炸薯片,还会发生美拉德反应,使薯片呈黑色或褐色,味苦,同时还会产生丙烯酰胺等致癌物。上述现象严重损害了马铃薯的品质。因此为了满足工业加工和食用的需求,如何使马铃薯能够抗低温糖化是亟需解决的问题。RNA干扰(RNAinterference,RNAi),是由内源的或者外源的双链RNA引起的序列特异性的基因沉默。通过小分子的双链RNA抑制互补基因的表达,产生转录后水平的基因沉默,达到调节或关闭基因的表达,进而有目的地调控植物的新陈代谢活动。本研究基于RNA干扰原理,以马铃薯块茎中控制直链淀粉合成的关键酶——颗粒结合型淀粉合成酶基因(Granule-BoundStarchSynthaseⅠ,GBSSⅠ)和在低温糖化中起关键作用的酸性液泡转化酶基因(VacuolarAcidInvertasegene,VInv)作为靶标基因,用沉默载体pHellsgate12携带612bp的GBSSⅠ基因片段和510bp的VINV基因片段构建成能同时沉默两个基因的沉默载体,以期获得含高纯度支链淀粉的马铃薯品种同时能够长时间在低温条件下储藏,不会发生糖化现象。本研究成功构建了能同时沉默两个基因的载体(PH-G+I)、单独沉默GBSSⅠ基因的载体(PH-GBSS)、单独沉默VINV基因的载体(PH-VINV)。通过农杆菌介导的转化方法获得马铃薯转化株。再经过PCR鉴定,获得阳性株。挑选一部分阳性株在土壤中栽培收获薯块,用获得的薯块检测各株系的GBSSⅠ基因和VINV基因的表达量,其中大部分株系的沉默效率均在70-90%之间。测定PH-G+I载体的转化株和PH-GBSS载体转化株薯块的直链淀粉含量,其中支链淀粉含量最高的株系可达99.2%。经过低温储藏后检测还原糖含量,结果表明大多数株系中的蔗糖含量略有上升,而葡萄糖和果糖含量则显著下降。在炸薯片实验中,经过低温储藏后的薯块炸片,转基因株系的颜色显著好于对照,在转录水平相似时单独沉默VINV基因的株系的薯片颜色要好于共同沉默GBSS+VINV基因的株系。G+I1和G+I10这两个株系在支链淀粉含量、低温储藏后炸片等检测中结果都很令人满意。
【作者】刘永强；
【导师】张若芳；
【作者基本信息】内蒙古大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】RNAi；高支链淀粉；低温糖化；还原糖含量；薯片颜色；

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