肺纤维化过程中肌成纤维细胞活化的调控机制及干预研究

【摘要】研究背景与目的：肺纤维化特征性表现为进行性细胞外基质沉积,肺组织结构破坏,肺功能逐步丧失。肌成纤维细胞活化是肺纤维化发生的核心环节,标志性的高表达有α-平滑肌肌动蛋白(smoothmuscleactin,SMA)的肌成纤维细胞主要通过上皮-间质转化(epithelialtomesenchymaltransition,EMT)和原位成纤维细胞的激活与转化两种方式来源,因而将肌成纤维细胞作为治疗靶点,阻断其活化过程,有望成为治疗纤维化疾病的新策略。本论文也将围绕肌成纤维细胞的活化及调控机制展开,分别从上皮-间质转化和原位成纤维细胞的转化两个角度进行研究。研究发现白细胞介素(inerleukin,IL)-22在诸多肺部病理生理过程中发挥作用,并且可靶向作用于肺泡上皮细胞,故本研究第一部分旨在探讨IL-22在博来霉素诱导的肺纤维化动物模型中的变化与作用,以及对上皮-间质转化的调控机制。酪氨酸激酶拮抗剂AP24534对c-Abelsontyrosinekinase(c-Abl)、转化生长因子(transforminggrowthfactor,TGF)-β1、血小板源性生长因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)和血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)家族的酪氨酸受体的活性有广泛的抑制作用,且有证据显示以上因子可参与肺纤维化的发生。故本研究第二部分旨在探讨新型制剂AP24534在肌成纤维细胞活化中的干预作用及调控机制。研究方法：1)本研究第一部分体内实验采用小剂量博来霉素气管内单次注射诱导的肺纤维化小鼠模型,通过组织病理学观察肺纤维化的程度,通过Western印迹和实时定量PCR检测上皮-间质转化相关指标的变化,以及IL-22的表达变化；原代分离培养小鼠肺组织和脾脏淋巴细胞,通过流式分析技术检测IL-22表达细胞在肺纤维化小鼠肺组织和脾脏中的水平；外源性给予人肺泡上皮细胞系A549细胞重组IL-22处理,采用Western印迹检测α-SMA的表达变化,通过CCK-8法检测细胞增殖水平；采用抗IL-22中和抗体腹腔内注射肺纤维化小鼠,通过组织病理学观察肺纤维化的程度,研究通过Western印迹和实时定量PCR检测上皮-间质转化相关指标的变化,以及TGF-β和Smad2的磷酸化水平；2)本研究的第二部分采用重组TGF-β1处理小鼠成纤维细胞系NIH/3T3细胞建立成纤维细胞-肌成纤维细胞转化的体外细胞模型；给予NIH/3T3成纤维细胞AP24534预处理,再给予TGF-β1诱导,通过Western印迹或实时定量PCR检测I型胶原,α-SMA,Vimentin和金属蛋白酶MMP9的表达变化；通过siRNA干扰技术阻断c-Abl在成纤维细胞中的表达,再通过同样方法给予TGF-β1处理,检测上述纤维化相关指标的变化；通过Western印迹或免疫荧光的方法检测AP24534对TGF-β1诱导的Smad通路,JNK通路和AKT/mTOR信号通路相关蛋白及其磷酸化的水平的变化。研究结果：1)博来霉素诱导的肺纤维化小鼠在造模后的1-8周呈现出进行性的上皮-间质转化现象,伴有肺组织中IL-22的水平的下降,于第3周最为显著；肺纤维化小鼠肺部和脾脏中的表达IL-22的γδT细胞水平在第3周时明显低于对照小鼠；体外采用重组IL-22处理A549细胞可以缓解博来霉素诱导的EMT,表现为EMT的标志物α-SMA的过表达被抑制,同时可部分逆转博来霉素诱导的上皮细胞增殖能力的下降；体内实验采用抗IL-22中和抗体腹腔注射肺纤维化小鼠,可明显加重肺纤维化的程度：H&E及Masson’s三色染色显示肺泡结构的破坏及细胞外基质沉积的加重,Ⅰ/Ⅲ型胶原,α-SMA和金属蛋白酶MMP9的表达也增加,同时TGF-pmRNA和蛋白水平及Smad2磷酸化水平进一步上调。2)采用TGF-β1刺激NIH/3T3细胞能够明显诱导NIH/3T3成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,主要表现为肌成纤维细胞标志物α-SMA,以及Vimentin,Ⅰ型胶原和金属蛋白酶MMP9表达上调,而给予NIH/3T3细胞AP24534预处理可以明显抑制由TGF-β1诱导肌成纤维细胞转化,AP24534预处理能够阻断由TGF-β1诱导的c-Abl的活化,而通过基因敲除c-Abl也可阻断由TGF-β1诱导的肌成纤维细胞的转化；以AP24534处理NIH/3T3细胞可抑制由TGF-β1诱导AKT,mTOR(mammaliantargetofrapamycin)和核糖体蛋白S6激酶(S6ribosomalprotein,S6)的磷酸化,但不能抑带Smad3的磷酸化和核转位,以及JNK和c-Jun的磷酸化。研究结论：1)本研究第一部分结果提示IL-22在博来霉素诱导的肺纤维化中起保护作用,通过干预TGF-β/Smad通路来抑制上皮-间质转化的过程进行调控的,提示了IL-22在肺纤维化中的治疗作用；2)AP24534能够显著抑制由TGF-β1诱导的肌成纤维细胞的活化；c-Abl的活化在TGF-β1诱导的肌成纤维细胞活化过程中起重要作用,AP24534能够通过抑制c-Abl的活化对纤维化过程进行调控；AP24534能够通过AKT/mTOR/S6通路对肌成纤维细胞的活化进行调控,但其抗纤维化的作用不依赖于Smad通路和JNK通路,提示了AP24534在肺纤维化疾病诊治中的应用前景。
【作者】梁敏锐；
【导师】邹和建；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2013，博士
【关键词】肺纤维化；肌成纤维细胞；上皮-间质转化；白细胞介素-22；酪氨酸激酶拮抗剂；靶向治疗；

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