miR-181b抑制TGFBR1表达在肺纤维化过程中的作用及机制研究

miR-181b抑制TGFBR1表达在肺纤维化过程中的作用及机制研究

作者:师大云端图书馆 时间:2018-09-14 分类:参考文献 喜欢:3661
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【摘要】目的:研究miR-181b对肺纤维化过程的调控作用,并对其作用机制进行进一步探讨。方法:收集7例特发性肺纤维化患者和9例正常人肺活检组织,并取正常小鼠和博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型的肺组织,提取RNA检测miR-181b水平。将A549细胞分为control组、mimic-NC组、mimic组、inhibitor组和inhibitor-NC组。control组无干预;mimic组加入miR-181b的激动剂mimic;inhibitor组加入miR-181b的抑制剂inhibitor,mimic-NC组和inhibitor-NC组分别为mimic组和inhibitor的阴性对照组,加入无活性的microRNA。转染后,通过westernblot检测TGFBR1表达。同时,将TGFBR1mRNA3’UTR构建入luciferase报告系统(TGFBR1-3’UTR-wt),同时将突变后的TGFBR1mRNA3’UTR也插入luciferase报告系统中(TGFBR1-3’UTR-mut1,TGFBR1-3’UTR-mut2和TGFBR1-3’UTR-mut3)。然后将miR-181b与luciferase空质粒(emptyvector)或TGFBR1-3’UTR-wt质粒或TGFBR1-3’UTR–mut1/2/3质粒共同转染至HEK-293细胞中,检测各组细胞中的荧光强度。将30只小鼠分为对照组、miR-181b组和GFP组,每组10只小鼠。对照组小鼠不作任何处理,miR-181b组经尾静脉注射入rAAV-miR-181b载体使miR-181b在小鼠体内过表达;GFP组经小鼠尾静脉注射入rAAV-GFP载体。所有小鼠经博来霉素刺激诱导特发性肺纤维化模型,模型制作成功后,处死小鼠取肺组织,HE染色和Masson染色检测肺病理变化和胶原沉积情况,westernblot检测TGFBR1、磷酸化SMAD2和SMAD3蛋白的表达。结果:IPF病人肺组织中的miR-181b表达水平只有正常人肺组织中的1/3,而与正常小鼠相比,IPF小鼠肺组织中miR-181b表达水平更低,约下调4倍左右。miR-181bmimic可显著降低A549细胞中TGFBR1水平(p<0.05),而miR-181binhibitor可显著升高A549细胞中TGFBR1水平(p<0.05),5组细胞中的TGFBR1mRNA水平并无明显差异。luciferaseassay结果显示转染miR-181b后,TGFBR1-3’UTR-wt组荧光强度明显低于其阴性对照组(miR-con),和TGFBR1-3’UTR-mut1/2组荧光强度也不同程度的低于其阴性对照。而TGFBR1-3’UTR-mut3组或空质粒组(emptyvector)荧光强度与其阴性对照无明显差异。miR-181b组小鼠肺纤维化程度明显高于BLM组和GFP组,但仍高于对照组;BLM组小鼠肺纤维化程度与GFP组无明显差异。转染AAV5-miR-181b的IPF小鼠模型肺组织内TGFBR1、p-SMAD2和p-SMAD3的表达量明显低于对照组和Vector组小鼠(p<0.05)。结论:miR-181b在特发性肺纤维化疾病进程中表达下调,过表达miR-181b可在转录后水平通过下调靶蛋白TGFBR1表达,阻断肺组织中TGF-β信号通路的传导,从而减轻肺纤维化的程度。
【作者】白晓雪;
【导师】华树成;
【作者基本信息】吉林大学,临床医学,2014,硕士
【关键词】特发性肺纤维化;转化生长因子β;微小RNA;博来霉素;腺相关病毒;

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