肺炎链球菌溶血素Ply蛋白疫苗及BLP技术应用的研究

【摘要】肺炎链球菌是种常见的致病菌。它是社区获得性肺炎最主要的致病原，同时还能够引起鼻窦炎、中耳炎和脑膜炎等。并且在HIV感染者中，肺炎链球菌还能够引起菌血症等疾病。在众多发展中国家中，肺炎链球菌所引起的肺炎是老人与儿童最主要的杀手之；而在发达国家中，由肺炎链球菌导致的中耳炎也是儿科中最常见的疾病之。目前，临床上被广泛使用是肺炎链球菌结合疫苗。这种疫苗通过将肺炎链球菌的荚膜多糖结合在载体蛋白上以提高免疫原性。但是结合苗疫苗到血清型的限制，且由于工艺复杂成本高昂，在发展中国家无法大规模推广。肺炎链球菌蛋白疫苗则由于具有血清型不依赖、相对廉价、免疫原性好等特点，而成为了目前肺炎链球菌疫苗研发的热点。肺炎链球菌溶血素蛋白（Ply）是肺炎链球菌主要的毒力因子之，在肺炎链球菌侵袭和定植的过程中发挥着重要的作用。同时在已发现的各株肺炎链球菌间具有良好的保守性。正是由于具有这些特性，本论文将Ply蛋白作为肺炎链球菌蛋白疫苗组分之。Ply作为溶血素，其野生型具有很强的细胞毒性，无法直接作为疫苗的免疫原使用。野生型Ply通过其羧基末端的色氨酸富集环（Trp-richloop）插入到细胞膜上，并寡聚化形成小孔，从而造成细胞膜破碎。色氨酸富集环在Ply发挥其溶血活性的过程中发挥着重要的作用。本研究对Ply色氨酸富集环上两个关键的氨基酸位点进行点突变，设计了Ply的减毒突变体PlyM2。利用大肠杆菌原核表达系统成功表达了PlyM2及PlyWT，并进行了纯化。经过变温圆二色谱与变温荧光光谱检测，证明了PlyM2相对于其野生型PlyWT，结构无大改变、热稳定性略有降低。通过减毒安全性实验证明了PlyM2无明显细胞毒性，减毒成功。对小鼠使用氢氧化铝佐剂皮下免疫PlyM2，证明了PlyM2具有良好的免疫原性。且在小鼠肺炎链球菌血清型14鼻腔攻毒模型中，得到了与市售疫苗相近的保护率。在传统的皮下免疫方式之外，本论文还尝试使用Bacteria-LikeParticle(BLP)技术以进行鼻腔免疫。BLP技术是指：乳酸乳球菌经过热酸处理后，核酸及绝大部分蛋白质均被酸解，仅残留肽聚糖骨架形成的细菌样颗粒，将融合了肽聚糖结合标签的抗原蛋白结合在这样的颗粒表面，形成个具有细菌状态的免疫原。这样的免疫原保持有细菌样的形态，具有良好的免疫原性，特别适合于需要黏膜免疫的疫苗应用。本论文成功构建了带有肽聚糖标签的融合蛋白PlyPA。将PlyPA结合到BLP上，并通过免疫荧光共聚焦显微观察证明了PlyPA成功的结合在了BLP的表面。用BLP-PlyPA鼻腔免疫小鼠，证明了这种方式相较传统的氢氧化铝佐剂皮下免疫方式能够获得更高的呼吸道粘膜中IgA产生量。上述实验证明了PlyM2作为肺炎链球菌蛋白疫苗组分之的可行性，并提供了可行的鼻腔免疫的方式。
【作者】侯宏嘉；
【导师】吴永革；
【作者基本信息】吉林大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】肺炎链球菌溶血素；肺炎链球菌蛋白疫苗；新型佐剂；BLP技术；

【参考文献】
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