大豆发根转化方法的建立及GmFRD3在大豆耐铝性中的作用

【摘要】酸性土壤约占世界土壤总面积的30%，世界上约70%的潜在可耕地土壤属于酸性土壤（pH<5）。铝（Aluminium，Al）毒被认为是酸性土壤上作物产量的重要限制因子之一。酸性土壤中较高浓度的Al3+抑制了根的伸长并且限制了植物对水分和养分的吸收。许多植物通过根部分泌有机酸耐铝。跟这一特点相关的基因主要属于两个基因家族：铝诱导的苹果酸转运体(ALMT)家族和柠檬酸转运体(MATE)家族。大豆主要通过分泌柠檬酸来耐铝。大豆的GmFRD3基因属于MATE家族，但它在大豆耐Al中的作用尚未明确。为了研究大豆耐铝分子机制，本试验建立了高效的大豆发根转化方法并从大豆耐铝品种吉育70中克隆得到GmFRD3，并对它进行结构分析，并探讨了GmFRD3在大豆耐铝性中的作用。具体实验结果如下：1.利用发根农杆菌K599建立了高效的转化方法，使用这种方法，几乎所有被侵染的大豆幼苗从开始侵染的一周后就形成发根。所形成的所有发根中转基因的发根占总数的30%-60%。2.利用RT-PCR从大豆吉育70根尖扩增得到GmFRD3和它的启动子。GmFRD3的ORF全长1674bp，编码558个氨基酸，包含12个跨膜结构域，六个跨膜环。GmFRD3启动子ORF全长1543bp。将GmFRD3启动子在烟草叶片中进行瞬时表达，结果表明GmFRD3启动子具有启动活性。3.构建了GmFRD3的绿色荧光蛋白（GFP）融合表达载体并转进拟南芥原生质体，证明GmFRD3蛋白定位于细胞膜上。4.利用实时荧光定量PCR分析了GmFRD3的表达特性，结果表明GmFRD3在各组织中均有表达，但在根部表达量明显高于其它组织。不同时间点铝胁迫处理后，其表达量在4h开始迅速升高，在8h表达量达到最高值，然后逐渐减少，GmFRD3对铝胁迫有很强的响应。5.将GmFRD3构建到植物过表达载体pCAMBIA3301上，将这个融合表达载体及空载转化进大豆发根。用苏木精染色并测定柠檬酸的分泌速率。和对照（野生型及空载）比较表明过表达GmFRD3基因不仅促进了转基因发根柠檬酸的分泌速率还提高了它的耐铝性。这些结果说明GmFRD3在大豆耐铝中起了重要的作用。
【作者】陈安乐；
【导师】杨振明；
【作者基本信息】吉林大学，植物营养学，2014，硕士
【关键词】大豆；发根转化；GmFRD3；柠檬酸分泌；

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