一种调控脑胶质瘤表达B7-H3的新MicroRNA-Mir-339-5p的发现及其对脑胶质瘤细胞侵袭作用的研究

【摘要】脑胶质瘤是中枢脑系统最常见的恶性肿瘤，约占人颅内肿瘤的45%-60%，侵袭性生长是脑胶质瘤的一个重要特征。肿瘤细胞这种侵袭性生长的行为限制了脑胶质瘤局部治疗如手术切割和放疗等手段的可行性和有效性。因此探索脑胶质瘤病理进程的分子机理和基于此的新靶点业已成为诊断和治疗脑胶质瘤的研究热点。B7-H3是参与肿瘤免疫逃逸的重要负性B7家族分子，已有研究表明，B7-H3分子在诸多肿瘤组织包括脑胶质瘤中存在异常表达，并与肿瘤生物学行为直接相关。但是B7-H3在脑胶质瘤异常表达的调控机制以及其确切的临床意义尚不清楚。MicroRNAs，一种非编码蛋白质的单链小分子RNA(大约22nt)，可在转录后水平调控基因翻译，在脑胶质瘤细胞的生物学特性调控包括细胞增殖、转移侵袭、分化及肿瘤干细胞等方面起重要的作用。有研究发现miR-29a可以靶定B7-H33’-UTR序列，并调控成神经细胞瘤细胞B7-H3的表达。但是否存在其它调控脑胶质瘤B7-H3的microRNA，并且microRNA对B7-H3的调控在脑胶质瘤细胞侵袭中的作用及机制还有待进一步的研究。鉴此，本课题通过生物学信息方法预测和双荧光素酶报告系统检测相结合，发现miR-339-5p具有调控B7-H3表达的作用，在此基础上分析其在脑胶质瘤组织的表达及临床意义。并且通过体外转染miR-339-5p到脑胶质瘤U87细胞株，探讨miR-339-5p调控B7-H3和脑胶质细胞侵袭的可能作用机制，为进一步探索脑胶质瘤侵袭的分子调控机制及为临床靶向治疗提供理论依据。本论文分为两个部分：一miR-339-5p对B7-H3表达的调控和其在脑胶质瘤中的表达及临床意义
【作者】高兵；
【导师】张学光；
【作者基本信息】苏州大学，免疫学，2014，硕士
【目的】：分析调控B7-H3在脑胶质瘤表达的mircroRNAs，并检测其对脑胶质瘤表达B7-H3的调控机制及临床意义。
【方法】：通过生物信息学的方法预测与B7-H33’-UTR序列存在结合位点的mircroRNAs，并分析脑胶质瘤原位瘤模型的microRNA芯片数据，获得可能调控B7-H3并在脑胶质瘤侵袭中起调控作用microRNAs，进而采用双荧光素酶报告系统验证对B7-H3表达调节作用的miRNAs，实时荧光定量（RT-PCR）的方法分析调控B7-H3的miRNAs在脑胶质瘤不同病理组织中的表达及临床意义。
【结果】：（1）microRNA在线预测（网址http://www.microrna.org）结果显示，在B7-H33’-UTR序列中存在20个不同的microRNA结合位点，通过脑胶质瘤原位瘤模型的microRNA芯片数据分析，得出3条较为特异性的microRNAs：miR-339-5p，miR-185-5p和miR-539-5p。经双荧光素酶报告系统验证，发现miR-339-5p可以直接靶定B7-H33’-UTR序列并下调B7-H3基因的表达，下调效果与已报导的miR-29a对B7-H3调控作用相似。（2）实时定量PCR结果显示，脑胶质瘤组织中miR-339-5p的表达与临床病理分级呈负相关，与B7-H3基因的表达也呈负相关。
【结论】：发现一种调控脑胶质瘤表达B7-H3的新的miRNA—miR-339-5p。初步结果显示，B7-H3在高级别脑胶质瘤组织中呈高表达，而miR-339-5p的表达呈下调，两者呈显著的负相关，由此表明，miR-339-5p可能在脑胶质瘤中参与B7-H3异常表达的调控。二miR-339-5p调控脑胶质瘤异常表达B7-H3和对肿瘤细胞侵袭性的作用探讨
【目的】：分析miR-339-5p在脑胶质瘤中对B7-H3分子的调节作用；观察miR-339-5p下调B7-H3对脑胶质瘤生物学特性的影响及可能的作用机制。
【方法】：采用基因转染技术将miR-339-5p转入脑胶质瘤细胞株U87细胞，通过流式细胞术和real-timePCR方法检测转染后B7-H3分子的蛋白和mRNA表达水平；通过细胞侵袭实验和CCK-8法检测miR-339-5p对脑胶质瘤细胞侵袭和增殖的影响；同时通过流式细胞术检测转染后U87中CXC趋化因子受体(CXCchemokinereceptor)CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4和CXCR7的表达。
【结果】：（1）流式细胞术和real-timePCR结果显示，转染miR-339-5p能够抑制脑胶质瘤细胞中B7-H3分子和B7-H3mRNA的表达；（2）细胞侵袭实验结果表明，转染miR-339-5p能够降低脑胶质瘤细胞的侵袭和转移能力，miR-339-5p的抑制剂能够逆转其作用；而对脑胶质瘤细胞的增值并没有影响；（3）转染miR-339-5p的脑胶质瘤细胞对CXCR4的表达有明显的下降，而其它趋化因子受体的表达没有明显改变。
【结论】：miR-339-5p可以下调脑胶质瘤中B7-H3的表达，并在体外实验证实其对脑胶质瘤细胞侵袭有抑制作用，但并不影响其增殖。同时转染miR-339-5p可以下调脑胶质瘤上CXCR4的表达，而CXCR4经microRNA在线软件预测并不存在miR-339-5p的结合位点，由此表明miR-339-5p抑制肿瘤细胞侵袭可能通过下调B7-H3表达来下调CXCR4信号途径，但确切机制还有待进一步探讨。小结本论文在研究小组之前的脑胶质瘤原位瘤模型的microRNA芯片数据基础之上，通过生物信息学预测的方法，分析出有3个可能调控B7-H3的microRNAs，经双荧光素酶报告系统验证发现miR-339-5p能够靶定B7-H3基因序列并下调其表达，下调效果与已报导miR-29a相似。进而分析B7-H3和miR-339-5p在脑胶质瘤组织和细胞中的表达发现，B7-H3的表达与miR-339-5p的表达呈负相关，与脑胶质瘤病理进程呈正相关，由此推测，B7-H3在脑胶质瘤中可能受到miR-339-5p的调控。因此，我们进一步通过体外转染实验发现，miR-339-5p下调了脑胶质瘤细胞株U87上B7-H3的表达，并抑制脑胶质瘤细胞的侵袭，但不影响肿瘤细胞的增殖。同时转染miR-339-5p还显著下调了化学趋化因子受体CXCR4的表达，表明miR-339-5p可能通过B7-H3和CXCR4相互作用影响肿瘤细胞的侵袭。
【关键词】miR-339-5p；胶质瘤；B7-H3；细胞侵袭；

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