调节性T细胞移植对实验动物脑缺血损伤的保护作用

【摘要】目的：脑缺血损伤可诱发强大的免疫炎症反应。免疫系统与缺血的脑组织之间的相互作用参与了脑中风的病理形成,因而成为了中风治疗的一个新靶点。近期的研究提示CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulatoryTcells,Tregs)作为一种自身的免疫调节细胞,其功能障碍可加重脑缺血后的脑损伤,因此可能是机体对抗脑缺血损伤后脑内炎症反应的一种内源性的自身保护机制。然而,目前尚未有研究对外源性给予调节性T细胞静脉移植输注是否可对脑缺血损伤起到保护作用进行过评估。故本研究拟1)明确调节性T细胞的静脉移植输注在啮齿类动物脑缺血模型中的神经保护作用；2)探讨潜在的细胞保护作用机制。方法：免疫磁珠双重选择细胞提取法提取健康成年C57BL/6J小鼠及SD大鼠CD4+CD25+调节性T细胞。线栓法制备小鼠及大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,缺血60分钟(小鼠)或120分钟(大鼠)后再灌注。将实验动物随机分为假手术对照组(Sham)、脑梗死组(MCAO),脑梗死组又分为静脉输注PBS组,静脉输注脾细胞(splenocytes,Sp)组和静脉输注调节性T细胞(Tregs)治疗组。分别于术后24h和72h对各组动物进行神经行为学评价,并在MCAO后3天,7天及28天对脑切片进行TTC染色或MAP2免疫组化染色,计算机图像分析系统测量脑梗死体积。各组动物于静脉输注调节性T细胞24h以及72h后经心脏取血并灌注后取脑制备脑组织冰冻切片,用免疫组织化学方法染色检测外周免疫细胞在脑组织中的浸润。用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、TGF-β表达水平的变化。为进一步探讨调节性T细胞所产生的神经保护作用,我们联合采用了Gr-1抗体特异性消除中性粒细胞,MMP-9基因敲除以及骨髓嵌合子技术以及体外Treg与中性粒细胞的共培养技术。通过流式细胞仪分析外周免疫细胞评估Treg治疗对于全身免疫功能的影响。结果：在小鼠局灶性脑缺血模型中,MCAO后2、6或24小时后静脉输注提纯的调节性T细胞可减少脑缺血后的脑梗死面积约50%,对神经功能的改善可持续至MCAO后28天。MCAO后2小时给予Treg静脉输注治疗具有最显著的治疗效果,且在大鼠脑缺血模型中也具有保护作用。值得一提的是脑缺血后Treg的有效治疗窗可长达24小时。在脑缺血后1天,脑内炎症反应、外周炎症细胞在损伤区脑组织内的浸润以及血脑屏障的破坏显著减轻。应用CD45.1的同类系小鼠以及细胞示踪技术,我们惊喜地发现Treg的神经保护作用并不需要其浸润至脑组织内或抑制小胶质细胞的激活,提示其可能在外周循环中发挥保护作用。应用Gr-1抗体中和消除体内中性粒细胞,基因敲除MMP-9或将MMP-9基因敲除的骨髓转移至野生型经照射的小鼠体内都可消除Treg的神经保护作用,显示Treg是通过抑制外周中性粒细胞来源的基质金属蛋白酶-9的产生,从而防止了血脑屏障的破坏。Treg与中性粒细胞共培养的体外实验进一步证实了Treg是通过细胞间相互接触的方式抑制中性粒细胞的MMP-9产生的。除了中枢神经保护作用以外,Treg治疗还显示出对中风后低淋巴血症具有缓解作用,提示此治疗有望改善中风后的免疫状态。结论：本研究提示CD4+CD25+调节性T细胞静脉输注移植是一种以中风后免疫功能紊乱为靶点的创新而有效的细胞治疗方法。调节性T细胞输注移植治疗通过抑制外周中性粒细胞MMP-9的产生保护了血脑屏障从而达到了早期的神经保护作用。
【作者】李佩盈；
【导师】梁伟民；
【作者基本信息】复旦大学，麻醉学，2013，博士
【关键词】脑缺血再灌注；调节性T细胞；输注移植；基质金属蛋白酶-9；血脑屏障；免疫调节；中性粒细胞；

【参考文献】
[1]郝伟.奥巴马对LGBT承诺中的“平等”[D].四川外国语大学,英语语言文学,2013,硕士.
[2]冯玲.基于能值理论的物流园区可持续发展对策研究[D].中南林业科技大学,企业管理,2014,硕士.
[3]范春楠.吉林省森林植被碳估算及其分布特征[D].东北林业大学,生态学,2014,博士.
[4]王翔宇.转BMP-2基因干细胞复合nHAC/PLA修复骨缺损的实验研究[D].山西医科大学,骨科,2013,硕士.
[5]董卫国.三维机织热塑复合材料制作微结构力学性能及复合固化过程的研究[D].天津工业大学,2003.
[6]王云.中国学习者英语心理动词语义组织和语义表征研究[D].苏州大学,英语语言文学,2013,博士.
[7]高松,贺仁睦,马进,张进.电力系统动态仿真误差评定准则研究[J].电力系统自动化,2006,04:6-10.
[8]李涛,冯勇,安澄全.变加权系数减小变结构系统抖振的设计方法[J].控制与决策,2000,06:645-648.
[9]张效宁.公共池塘资源困境研究[D].浙江工商大学,西方经济学,2013,硕士.
[10]苏鹏,郭慧林,彭三,宁生科.氮掺杂石墨烯的制备及其超级电容性能[J].物理化学学报,2012,11:2745-2753.
[11]付伟良,沈岳松,祝社民,沈树宝.W掺入对Ti0.8Zr0.2Ce0.2O2.4/Al2O3-TiO2-SiO2催化脱硝性能的优化[J].无机材料学报,2014,12:.
[12]王聪.晶体拉曼放大器和反斯托克斯激光器的理论与实验研究[D].山东大学,光学工程,2014,博士.
[13]翁健光.滑动支承直线进给系统静动态特性分析[D].南京理工大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[14]王坤林,游亚戈,张亚群.海岛可再生独立能源电站能量管理系统[J].电力系统自动化,2010,14:13-17.
[15]林国平.基于聚类的Web序列模式挖掘[J].漳州师范学院学报(自然科学版),2005,04:21-27.
[16]张敬宜.海因里希·伯尔作品《女士及众生相》的原型分析[D].上海外国语大学,德语语言文学,2012,硕士.
[17]车克君.经济全球化背景下提高基层人民银行履职能力的思考[D].河北师范大学,世界经济,2013,硕士.
[18]项坤.纳米Cu/PMMA微发泡复合材料的制备及其力学性能研究[D].武汉理工大学,2014.
[19]邬大鹏,程卫平,于盛林.基于帧间差分和运动估计的Camshift目标跟踪算法[J].光电工程,2010,01:55-60.
[20]汤胜强.缺席审判制度研究[D].湘潭大学,法律,2003,硕士.
[21]林由清.基于分布式存储的在线网盘系统的设计与实现[D].杭州电子科技大学,计算机系统结构,2013,硕士.
[22]董利戈.SDLT公司第三代移动通信业务竞争战略[D].西北大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[23]周爱莲.经阴道多普勒超声观察不孕症患者的子宫血流参数[D].山西医科大学,妇产科学（专业学位）,2013,硕士.
[24]宋欢.紫外光照射引发阳离子单体接枝丙纶无纺布及其吸附行为研究[D].苏州大学,纺织工程,2013,硕士.
[25]高致远.低检测复杂度的全速率双向协作中继传输方案[D].安徽大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[26]朱凯.航空精密铸件射线检测仿真及验证试验[D].南昌航空大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[27]阮志浩,胡治刚,庞智勤.向制造柔性化迈进[J].机械管理开发.1996(04)
[28]王艳荣.苏联解体后的俄语经济词汇[D].兰州大学,俄语语言文学,2014,硕士.
[29]Mary.中英科学家联手发现氧化石墨烯薄膜离子筛选效应[J].今日电子,2014,04:27.
[30]刘铮.辽宁广播电视台民生新闻《直播生活》栏目项目管理研究[D].吉林大学,项目管理,2014,硕士.
[31]梁立.丙烯“一步法”合成1-溴丙烷[D].广东工业大学,化学工艺,2004,硕士.
[32]吴挺.从中美战略稳定性看太空武器化问题[D].复旦大学,外交学,2012,硕士.
[33]付曦.中国上市公司并购问题研究[D].首都经济贸易大学,金融学,2004,硕士.
[34]张亮.门限自回归（TAR）模型及其在汇率波动问题中的研究[D].安徽工程大学,应用数学,2012,硕士.
[35]李传业.基于PLC的无糖组培箱微环境CO_2增施监控系统的研究[D].中国农业大学,农业生物环境与能源工程,2004,硕士.
[36]蔡本晓.Ka频段地空路径衰减与去极化及功率控制算法研究[D].西安电子科技大学,无线电物理,2004,硕士.
[37]张晓勇.石墨烯偶氮功能化及重氮盐功能化[D].湖南大学,2014.
[38]黑金福.《隋书·经籍志》著录小说集解[D].华中师范大学,中国古代文学,2013,硕士.
[39]杨永耀,梁军.加热炉多模式控制[J].冶金自动化,1991,05:15-19.
[40]张丽.农村初中教师绩效工资实施现状研究[D].西北师范大学,教育经济与管理,2013,硕士.
[41]苏朱刘,胡文宝.AB-s方式瞬变电磁测深资料处理方法研究[J].石油地球物理勘探,2002,03:262-266+286-306.
[42]董普丽.论熟食品安全监管模式的完善[D].西南政法大学,经济法学,2012,硕士.
[43]张小勇.腐蚀海底管道极限承载力和失效机理研究[D].浙江大学,2013.
[44]程燕.中行甘肃省分行零售贷款业务风险管理策略研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[45]解生勇.变频器售后服务顾客感知价值评价模型及应用[D].华东理工大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[46]来晓.基于“错题档案”的研究谈小学生数学错误的成因与对策[D].杭州师范大学,学科教学（专业学位）,2011,硕士.
[47]郭静.体育院校表演专业健美操专选课对学生艺术素质影响的研究[D].南京体育学院,体育教育训练学,2012,硕士.
[48]易晨阳.城市轨道交通大型活动散场客流传播与协调控制[D].北京交通大学,2015.
[49]董兆斌.一种估计信噪比的方法[J].石油地球物理勘探,1981,02:70-75.
[50]冯霄.基于中间语义的场景分类算法的研究[D].中南民族大学,生物医学工程,2013,硕士.