药物过量时激活PXR介导调控药物代谢酶与转运体转录促进毒物消除的解毒机制研究

【摘要】研究目的：1.基于“上调MDRl基因、诱导P-gp外向转运解除中枢抑制药物中毒”的机制研究,采用ATP酶活性测试法,考察待测药物对P-gpATP酶活性的影响,明确药物是否为P-gp底物,初步建立临床中毒多发的中枢抑制药物P-gp底物谱,从而明确适合该中毒解救治疗方案的药物。2.采用药物跨膜双向转运法,考察待测中枢抑制药物在血脑屏障上的转运特性,并进一步确证P-gp是否参与这些药物在血脑屏障上的转运。3.考察在常规剂量与中毒剂量下,药物本身对大鼠肝脏、前额叶皮质与海马中PXR信号通路调控I相代谢酶CYP3A4和Ⅲ相转运体P-gp的影响,并考察药物过量中毒情况下给予PXR激活剂对大鼠肝脏、前额叶皮质与海马中PXR、CYP3A4与P-gp的mRNA与蛋白表达水平的影响,从而揭示通过激活PXR信号通路调控药物代谢酶与转运体协同促进药物消除的分子机制,以期为开辟新的药物中毒救治途径奠定基础,为研究新型解毒药物提供新的思路。研究方法：1.经文献调研,很多中枢抑制药物均为P-gp的底物或调节子。以建立中枢抑制药物P-gp底物谱为目标,制定研究药物的入选标准并纳入待研究药物。建立ATP标准曲线后,以P-gpATP酶抑制剂四氧嘧啶作为阴性对照,以P-gpATPase诱导剂维拉帕米作为阳性对照,用多功能酶标仪检测高、中、低浓度的待测化合物的荧光强度,经数据处理后得到△RLUbasal与△RLUTc值并比较二者的大小,考察待测药物对P-gpATPase活性的影响。2.采用人脑微血管内皮细胞与人星形胶质细胞共培养的方式建立人血脑屏障体外模型,并对模型特征进行评价,通过MTT法确定各药物对细胞的无毒浓度范围,建立并验证细胞转运液中各待测药物的定量分析方法,以P-gp荧光性探针底物Rh-123作为阳性对照,采用双向转运法考察入选的中枢抑制药物跨血脑屏障的转运特性,并考察P-gp抑制剂对药物跨血脑屏障转运的影响,进一步确证P-gp是否参与这些药物在血脑屏障上的转运。3.选择喹硫平为中毒的模型药物,选择SD大鼠为中毒模型动物,选择地塞米松为核受体PXR的诱导剂。SD大鼠随机分为4组,即空白组(Control组),喹硫平常规剂量组(Normal组),喹硫平中毒未干预组(Toxic组),以及喹硫平中毒地塞米松干预组(Toxic+Dex组),按分组进行不同处理后,于预先设定的时间点采集大鼠的肝脏、前额叶皮质与海马,利用Real-timePCR与Western-blot分子生物学技术,考察不同时间点各组大鼠的肝脏、前额叶皮质与海马中核受体PXR、Ⅰ相代谢酶CYP3A4、Ⅲ相转运体P-gp的mRNA与蛋白表达水平,并对数据进行统计分析。研究结果：1.舒必利、齐拉西酮、西酞普兰组的RLU值均大于维拉帕米组,推测这3个药物对P-gp的亲和力比维拉帕米弱。舒必利、齐拉西酮、西酞普兰其ARLUTc均小于ARLUbasal,推测其可能为ATP酶抑制剂,可能会通过抑制ATP酶活性而抑制P-gp；高、中、低浓度的舒必利、齐拉西酮、西酞普兰的RLU值无明显差异,推测其对P-gp的抑制作用无浓度依赖性。高浓度的佐匹克隆与吗氯贝胺其RLU值小于维拉帕米组,由此推测其在反应过程中消耗ATP较多,故与P-gp的亲和力较强；不同浓度的氯米帕明、中、低浓度的佐匹克隆与吗氯贝胺的RLU值大于维拉帕米组,对P-gp的亲和力比维拉帕米弱。佐匹克隆、氯米帕明、吗氯贝胺在高浓度时△RLUTc大于△RLUbasal,在中、低浓度时其△RLUTc小于△RLUbasal,由此推测这3个药物在高浓度时对P-gp有诱导作用,在中、低浓度时可通过抑制ATP酶的活性从而抑制P-gp。2.采用人脑微血管内皮细胞与人神经星形胶质细胞共培养方式所建立的体外血脑屏障模型具有高致密、低通透、表达转运体等特征,建立较为快速、灵敏、特异的药物浓度测定方法用于跨膜双向转运实验,结果显示,与阳性对照Rh-123所得结果相似,低、中、高浓度的舒必利与西酞普兰的Papp(A-B)<Papp(B-A)且ER>2,B→A方向的转运高于A→B方向的转运,表现出极性转运特征,推测舒必利和西酞普兰为血脑屏障上P-gp的底物。当加入P-gp抑制剂后,低、中、高浓度的舒必利与西酞普兰的Papp(A-B)值增大,Papp(B=A)值减小,所得ER值接近1,提示当P-gp转运功能受到抑制时,P-gp底物双向转运失去极性转运特性,该结果进一步证明P-gp介导舒必利和西酞普兰在体外血脑屏障上的双向转运。研究还发现,低、中、高浓度的吗氯贝胺、佐匹克隆和氯米帕明Papp(A-B)值略高于Papp(B-A)值且ER<1,提示吗氯贝胺、佐匹克隆和氯米帕明不具有极性转运特征,不是P-gp的底物；当加入P-gp抑制剂后,低、中、高浓度的吗氯贝胺、佐匹克隆和氯米帕明的表观渗透率(Papp)未发生显著变化,所得ER值仍然小于1,该结果提示P-gp抑制剂维拉帕米对吗氯贝胺、佐匹克隆和氯米帕明的转运没有影响,P-gp不参与其在体外血脑屏障上的转运。3.腹腔注射给予大鼠常规剂量喹硫平后,大鼠的肝脏、前额叶皮质与海马中核受体PXR、药物代谢酶CYP3A4和药物转运体P-gp的基因与蛋白表达水平高于空白组；腹腔注射给予大鼠常规剂量与中毒剂量喹硫平后,QTP中毒未干预组(Toxic组)的大鼠肝脏、前额叶皮质与海马中PXR、CYP3A4、P-gp的表达水平高于QTP常规剂量组(Normal组)；腹腔注射给予大鼠中毒剂量喹硫平后,QTP中毒DEX干预组(Toxic+Dex组)大鼠肝脏、前额叶皮质与海马中PXR、CYP3A4、P-gp的表达水平高于QTP中毒未干预组(Toxic组)。Toxic+Dex组大鼠体内PXR-药物代谢酶CYP3A4/转运体P-gp信号通路上调更快。结论：1.舒必利、齐拉西酮、佐匹克隆、氯米帕明、西酞普兰及吗氯贝胺均为P-gp底物(或抑制剂),其中,舒必利、齐拉西酮、西酞普兰为非浓度依赖的ATP酶抑制剂,高、中、低浓度的各药物对ATP酶的抑制作用无明显差异；佐匹克隆、氯米帕明与吗氯贝胺为浓度依赖的ATP酶双向调节剂,在高浓度时可诱导ATP酶活性,对P-gp具有诱导作用,中、低浓度时可抑制ATP酶活性,对P-gp具有抑制作用。2.双向转运实验结果提示,舒必利与西酞普兰为P-gp的底物,P-gp介导其跨血脑屏障的转运；吗氯贝胺、氯米帕明与佐匹克隆不是P-gp的底物,P-gp不参与其跨血脑屏障的转运。结合ATP酶活性测试所得结果,推测吗氯贝胺、氯米帕明与佐匹克隆可能是P-gp抑制剂。将所得研究结果与文献调研结果相结合,成功建立中枢抑制药物P-gp底物(毒物)谱,明确了适合“上调MDRl诱导P-gp表达增加中枢抑制药物外排”这一解救治疗方案的药物,为临床药物中毒的解毒治疗提供了新的依据和手段。3.喹硫平可自我诱导核受体PXR-药物代谢酶CYP3A4/转运体P-gp这一信号通路,当药物过量时药物的这种自我诱导效应更为明显,并且核受体PXR激动剂可协同性地上调信号通路下游的药物代谢酶CYP3A4与转运体P-gp的基因与蛋白表达水平。在药物过量中毒时,激活PXR可快速有效激活解毒系统,从而可能达到快速清除体内毒物以及保护机体免受毒物侵害的目的。本研究的实施有助于阐明药物中毒时核受体PXR对代谢酶和转运体的调控特征及分子机制,从而为开辟新的药物中毒救治途径奠定基础,为研究新型解毒药物提供新的思路。
【作者】戴立波；
【导师】李焕德；
【作者基本信息】中南大学，药学，2014，博士
【关键词】中枢抑制药物；孕烷X受体；P-糖蛋白；药物代谢酶；中毒救治；

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