TWIST2-ID2轴调控CML干/祖细胞生长和伊马替尼敏感性的研究

【摘要】目的：研究TWIST2-ID2轴调控正常造血和慢性粒细胞白血病（chronicmyelocyticleukemia，CML）干/祖细胞功能，并探讨其作用机制。方法：（1）收集CML患者及健康供体的骨髓样本，利用免疫磁珠富集CD34+细胞，通过实时定量PCR（QuantitativeReal-timePCR，Q-RT-PCR）和免疫荧光（Immunofluorescence，IF）检测TWIST2在CML及健康供体骨髓（normalbonemarrow，NBM）细胞中的表达；（2）利用磷酸钙沉淀制备用于沉默TWIST2的慢病毒，检测TWIST2沉默对NBM-CD34+细胞增殖能力的影响；（3）为了探究TWIST2作用的分子机制，制备TWIST2和它的四种变体，包括N-端缺失（ΔN）、C-端缺失（ΔC）、DNA结合区域（basicregion）突变、螺旋-环-螺旋结构域（helix-loop-helixdomain,HLH），使用慢病毒递送入CML细胞中，而后验证它们的表达；（4）以慢病毒为载体携带TWIST2及其四种变体转导MEG-01和K562细胞，采用细胞生长曲线、集落生成以及裸鼠皮下成瘤实验检测TWIST2及其变体对CML细胞增殖能力的影响；（5）Q-RT-PCR检测表达的影响，使用双荧光素酶报告基因系统研究TWIST2及其变体对ID2启动子（野生型和E-box突变型）转录活性的影响；（6）通过PCR方法克隆ID2的cDNA，并制备慢病毒载体检测ID2对CML细胞增殖，集落生成和IM敏感性的影响；（7）通过制备沉默ID2的病毒，检测干扰ID2后对K562及其NBM-CD34+细胞的增殖的影响；（8）在正常造血CD34+中共转导BCR-ABL和TWIST2沉默的慢病毒，检测二者单独及共同对集落生成能力的影响。结果：TWIST2沉默显著增强正常骨髓CD34+细胞的集落生成能力。ChIP证实TWIST2在正常骨髓CD34+细胞中结合ID2的启动子序列，TWIST2沉默抑制ID2的表达；ID2过表达能抑制TWIST2沉默增强的集落生成能力。CML患者（n=14）的CD34+细胞中的TWIST2和ID2的基因表达均较健康供体来源的对照细胞（n=6）显著降低，免疫荧光检测也证实CML细胞中二者的蛋白表达水平也降低。在正常CD34+中过表达BCR-ABL能够降低TWIST2的表达；而IM处理K562能增高TWIST2的表达。在BCR-ABL和TWIST2沉默慢病毒共转导正常CD34+的细胞能生成较二者单独转导细胞更多的集落。过表达TWIST2能够抑制CML包括患者CD34+细胞的生长和集落生成能力。TWIST2也显著抑制MEG-01细胞的裸鼠的皮下成瘤能力(TWIST2组0/8，对照组7/8)。过表达TWIST2显著增强CML细胞的IM敏感性。过表达TWIST2需要完整的HLH结构域发挥其生长抑制和增强细胞IM敏感性的功能。TWIST2能通过结合ID2启动子中唯一的E-box序列激活其转录。ID2沉默能部分恢复TWIST2导致的生长抑制和IM增敏，是TWIST2发挥其功能所必需的。结论：（1）TWIST2-ID2轴调控正常造血干/祖细胞的增殖；（2）CML干/祖细胞中TWIST2和ID2的表达受到抑制；（3）TWIST2-ID2轴调控CML干/祖细胞增殖及IM敏感性；（4）TWIST2是CML的新抑癌基因。
【作者】马文娟；
【导师】赵昀；
【作者基本信息】苏州大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】TWIST2；ID2；慢性粒细胞白血病；CD34；抑癌基因；

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