外泌体—电离辐射诱导旁效应的另一种机制

【摘要】目的：首先验证电离辐射是否在H460非小细胞肺癌细胞中诱导经培养液介导的旁效应；进而探索除细胞间隙连接和可溶性分子两种信号介导方式外的新的旁效应信号介导机制。在文献调研与预实验基础之上，探索外泌体是否为电离辐射诱导旁效应的一种介导机制。方法：采用条件培养液转移的方法，以DNA损伤、微核形成和克隆形成为指标，检测X射线在H460非小细胞肺癌细胞中诱导经培养液介导的旁效应。采用差速离心法从未辐照和辐照后的H460细胞培养液中提取、纯化外泌体，通过透射电子显微镜观察其形态，激光粒度仪分析粒径分布，并用WesternBlot检测其标志蛋白hsp90β的表达。另外，检测不同照射剂量以及照射后不同时间点细胞分泌外泌体的粒径分布。通过荧光探针共定位实验观察外泌体进入接收细胞。采用结晶紫实验检测外泌体对接收细胞增殖的影响，同时检测外泌体对接收细胞微核形成和克隆形成能力的影响。为探索外泌体中的RNA是否对引起接收细胞产生生物学变化发挥重要作用，预先将RNA酶与外泌体孵育以灭活外泌体内RNA，去除残留RNA酶后，将外泌体加入接收细胞中，观察接收细胞微核形成率的变化。本研究采用Origin8软件进行数据统计、分析和作图，采用Student’st-test进行统计学比较，当p值小于0.05时，认为两比较组间的差异具备统计学意义。全部数据均来源于最少三次独立重复实验，用平均值±标准方差表示。结果：1.条件培养液介导电离辐射旁效应。相对于未受照射条件培养液（SCM）转移组，将5GyX射线照射后1小时的H460细胞条件培养液（RCM）转移到未做任何处理的旁效应细胞，旁效应细胞微核形成率增加了80%，克隆形成率降低了13%。相对于未受照射条件培养液（SCM）转移组，将5GyX射线照射后18小时的H460细胞条件培养液（RCM）转移到未做任何处理的旁效应细胞，旁效应细胞微核形成率增加了3.5-5倍，克隆形成率降低了8.3%，DNA损伤增加了18%。并且，无论1小时还是18小时条件培养液转移，5GyX射线照射后的条件培养液和10GyX射线照射后的条件培养液产生的微核形成率没有明显差别。2.外泌体的分离和鉴定。采用差速离心法，可以简便、快速地获得外泌体。透射电镜下可见典型的外泌体“盘杯状”特征，大小在30-150nm。进一步通过WesternBlot检测普遍接受的外泌体标志物Hsp90β，确证提取物为外泌体。不管是否受到照射，H460细胞均分泌外泌体，但是在两种情形下细胞分泌的外泌体的粒径分布却完全不同。并且，细胞分泌的外泌体尺寸依赖于细胞受照剂量和照射后培养时间。3.外泌体与H460接收细胞的相互作用。将用荧光探针分别标记的外泌体与接收细胞共培养30分钟后，观察到从未受照射和受照射细胞培养液提取的外泌体均可迅速进入H460接收细胞中，可能是通过膜融合的方式。4.从条件培养液提取的外泌体可诱导接收细胞产生生物学效应。加入从未受照射细胞培养液提取纯化的外泌体不改变接收细胞的微核形成率，然而，从受照射细胞培养液提取纯化的外泌体使接收细胞的微核形成率增加了两倍。用RNA酶预先除去外泌体中RNA，再将此外泌体加入接收细胞，之前观察到的细胞受照后条件培养液中提取的外泌体使接收细胞的微核形成率增加的生物学效应消失。另外，不管是否受照，与新鲜培养液对照组相比，H460细胞分泌的外泌体均能促进接收细胞增殖（增加11%左右）。但是，不管是否受照，与新鲜培养液对照组相比H460细胞分泌的外泌体均不影响接收细胞的克隆形成率。结论：1.X射线可在H460细胞中诱导经培养液介导的电离辐射旁效应。2.不管是否受到照射，H460细胞均分泌外泌体，但是两种情形下外泌体的粒径分布却完全不同。细胞分泌的外泌体尺寸依赖于细胞受照剂量和照射后培养时间。3.外泌体可能通过膜融合的方式进入H460接收细胞。4.外泌体可能是电离辐射旁效应的一种介导机制，并且其中RNA可能是一种重要的旁效应信号分子。
【作者】陈纤；
【导师】杨红英；
【作者基本信息】苏州大学，放射医学，2014，硕士
【关键词】电离辐射旁效应；外泌体；微核；细胞增殖；人非小细胞肺癌；

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