癌基因RMP在肝癌上皮间质转化中的作用及其与肿瘤侵袭转移的关系

癌基因RMP在肝癌上皮间质转化中的作用及其与肿瘤侵袭转移的关系

作者:师大云端图书馆 时间:2018-03-11 分类:参考文献 喜欢:3968
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【摘要】目的:通过研究RMP过表达和RMP干扰表达的HepG2细胞株的细胞形态、粘附能力和迁移侵袭能力的改变,探究RMP对肝癌细胞EMT的影响。方法:本实验室保存的RMP过表达质粒pCDNA3.1-RMP和RMP干扰质粒pGPU6-RMPi经双酶切鉴定无误后进行脂质体转染;确定肝癌HepG2细胞的G418药物筛选浓度;转染各组质粒后的HepG2细胞经G418筛选得到RMP过表达细胞株和RMP干扰表达细胞株;各细胞株分别通过RT-PCR,qRT-PCR,CCK-8实验鉴定所得细胞株中外源质粒的整合情况,检测RMPmRNA的表达水平和细胞增殖水平;倒置显微镜观察稳定转染细胞株的细胞形态;粘附实验检测RMP对肝癌细胞异质粘附能力的影响;划痕实验,Transwell侵袭迁移实验检测RMP过表达和干扰表达对肝癌细胞迁移和侵袭能力的改变;Transwell侵袭迁移实验探讨瞬时转染不同剂量pCDNA3.1-RMP质粒对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响;RT-PCR和明胶酶谱实验分别检测各组细胞的MMPs表达量和酶活性;WesternBlot检测各细胞株中E-cadherin、N-cadherin及Vimentin等EMT相关通路蛋白的表达水平。结果:1.经质粒双酶切鉴定,成功检测到RMP过表达质粒:pCDNA3.1-RMP中1619bp的重组RMP条带;RMP干扰质粒:pGPU6-RMPi中53bp的发卡条带。2.HepG2细胞于含不同浓度G418的培养基中培养14天后,得出600ng/μl为最佳G418药物筛选浓度。3.HepG2细胞转染各组质粒24h后,加入G418筛选14天,经单克隆挑取和单克隆扩大培养并鉴定,得到目标细胞株。4.倒置显微镜观察各组细胞形态,发现RMP过表达的HepG2细胞株细胞形态变为纺锤型,细胞与细胞间粘附消失。5.软琼脂克隆实验证明,RMP过表达能够促进肝癌细胞的锚定非依赖生长能力(p<0.01),干扰RMP表达后肝癌细胞锚定非依赖生长能力降低(p<0.05)。进一步分析结果发现,RMP过表达的HepG2细胞株形成的肿瘤微球形态松散,丧失细胞间粘附。而干扰RMP表达的HepG2细胞株所形成的肿瘤微球形态紧实,胞间粘附完整。6.粘附实验结果证明,RMP过表达能够降低肝癌细胞的异质粘附能力(p<0.001),干扰RMP表达则不影响肝癌细胞的粘附能力。7.划痕实验和Transwell实验证明了RMP过表达能促进肝癌细胞的迁移能力和侵袭能力(p<0.001),并且随RMP表达量的升高,细胞侵袭迁移能力也显著升高(p<0.001)。8.RT-PCR检测发现RMP过表达能够提高肝癌细胞中MMP-2,MMP-9的表达水平(p<0.001),干扰RMP则降低细胞中MMP-2,MMP-9的表达水平(p<0.001)。9.明胶酶谱实验则证明了RMP对细胞活性MMP-2的分泌是至关重要的(p<0.001)。10.Westernblot实验发现,RMP在肝癌细胞中过表达能够抑制上皮细胞标志物E-cadherin的表达(p<0.001),并促进间质细胞标志物N-cadherin和Vimentin的表达(p<0.001),干扰RMP表达则不影响上述三种蛋白的表达量。结论:1.RMP可以促进肝癌细胞的体外迁移,并且能够通过促进MMPs的表达,增强肝癌细胞的侵袭能力。干扰RMP表达则能够抑制这一现象。2.RMP能够影响肝癌细胞的细胞形态和3D培养中的集落形态,并上调间质细胞标志物N-cadherin,Vimentin,抑制上皮粘附分子E-cadherin,说明RMP过表达可以促进肝癌细胞EMT的发生,但干扰肝癌细胞中的RMP的表达却不影响细胞表型。
【作者】周围;
【导师】魏文祥;
【作者基本信息】苏州大学,细胞生物学,2014,硕士
【关键词】RMP;EMT;侵袭;迁移;

【参考文献】
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