zkscan3基因敲除小鼠模型的研究和EGFR分子转磷酸化机理的研究

【摘要】目的ZKSCAN3（人源）是一个新发现的转录因子，前期研究发现该基因在结肠癌的形成过程中起着一定的作用，ZKSCAN3在侵袭性结肠癌细胞和其肝脏转移病灶中过度表达，但在邻近的非转化组织中表达程度很低，但是,至今为止还没有系统的ZKSCAN3基因正常生理功能研究的报告，鉴于其在自噬、肿瘤病理生物学中的重要作用，通过zkscan3（鼠源）基因敲除小鼠模型来确定其正常的生理功能就具有十分重要的意义。方法1.通过CRE杂交系统敲除野生型小鼠的zkscan3基因的2号外显子，并对敲除小鼠的后代做基因型鉴定。2.采用RT-PCR方法半定量zkscan3基因在野生型小鼠各个器官的表达情况，为进一步研究做好前期准备。3.定量PCR，使用定量PCR进一步对zkscan3的敲除结果进行验证，同时使用定量精确分析zkscan3在小鼠胚胎成纤维细胞以及成年小鼠各个器官中的表达情况。4.使用流式细胞分析技术分析成年野生型小鼠和zkscan3敲除小鼠胸腺CD3+细胞及脾脏中CD3+、CD4+、CD8+细胞百分比含量的差别。5.分别用zkscan3敲除小鼠和野生型小鼠的CDNA进行Microarray分析，找出与zkscan3功能相关的基因。6.对小鼠进行人工抗原卡介苗刺激，检测小鼠体内免疫应答曲线，并检测小鼠血液指标。结果1.对杂交新生小鼠的基因鉴定结果显示，zkscan3基因的2号外显子确实被敲除。2.对小鼠各个器官进行RT-PCR结果显示，zkscan3在小鼠不同器官中表达存在明显差异，尤其在卵巢、睾丸以及胸腺中高表达。3.定量PCR结果显示，zkscan3基因2号外显子确实被敲除；而且zkscan3基因在野生型小鼠的不同器官中存在差异性表达，尤其在胃、卵巢、脾脏、前列腺和脾脏中高表达。4.流式细胞分析发现，敲除小鼠胸腺中CD3+淋巴细胞数量上比在野生型小鼠中有显著的升高；同时在脾脏中,CD4+淋巴细胞和CD8+淋巴细胞的细胞数量也比在野生型有显著升高。5.Microarray结果显示，敲除zkscan3后，表达发生显著变化的基因主要集中在神经系统、免疫系统以及生殖系统。6.对小鼠进行抗原免疫刺激后，发现与野生型小鼠相比，zkscan3基因敲除小鼠的免疫应答出现紊乱，血液检测指数显示，zkscan3基因敲除小鼠小鼠可能出现贫血症状。结论初步研究结果显示，zkscan3基因在小鼠体内可能是一个复杂的调控基因，根据已有数据推断，zkscan3很可能对免疫系统起到抑制的作用，在小鼠体内我们发现，它的敲除会导致小鼠免疫功能的上升，并且会造成免疫系统对外来抗原刺激的免疫应答紊乱，同时也会对神经系统以及生殖系统产生影响。目的表皮生长因子受体（EGFR），一个众所周知的致癌蛋白，在细胞生长、细胞周期和许多癌症疾病中起着重要的作用。虽然表皮生长因子受体的二聚化被认为是表皮生长因子受体激活的一个主要途径，但是有关表皮生长因子受体被激活之后，表皮生长因子受体之间如何相互作用进行转磷酸化以及自身磷酸化仍然不为所知。所以进一步研究EGFR在Y845位转磷酸化作用以及其自身磷酸化激酶活性将为EGFR活化及功能调节机制提供新的见解。方法1.免疫沉淀和免疫印迹2.体外激酶实验3.体外转磷酸化实验4.转染并稳定表达EGFR细胞株的建立5.细胞生长实验6.体外DNA掺入实验结果EGFR分子845位的酪氨酸转磷酸化会影响其自身自磷酸化。EGFR分子845位的酪氨酸突变后，转磷酸化作用缺陷的分子激酶活性消失。EGFR分子845位酪氨酸突变后，对其二聚体的磷酸化作用消失。EGFR分子845位酪氨酸突变后，其刺激细胞生长和DNA合成的能力下降。结论表皮生长因子受体EGFR，其845位酪氨酸的转磷酸化作用与表皮生长因子受体的子磷酸化作用以及激酶活性有关。当将表皮生长因子受体845位的酪氨酸替换为苯丙氨酸后，它对配体刺激作用的生物学反应消失，这说明了这一转磷酸化位点对其功能的重要性。所以，我们的研究结果使得对于表皮生长因子受体的激活认识更加深入，并可能为治疗各种与异常表皮生长因子受体表达和活化的癌症一个潜在的治疗靶点。
【作者】黄磊；
【导师】杨林；
【作者基本信息】苏州大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】小鼠模型；zkscan3；淋巴细胞；Microarray；表皮生长因子受体；转磷酸化作用；自磷酸化作用；激酶活性；癌症；

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