表达白介素-7的重组新城疫病毒修饰的自体肿瘤疫苗抗肿瘤作用及其机制研究

【摘要】目的：新城疫病毒修饰的自体肿瘤疫苗（ATV-NDV）在肿瘤治疗中有着较好的应用前景。白介素-7（IL-7）在淋巴细胞的发育和稳态的维持方面发挥着重要的作用。为了进一步提高ATV-NDV的抗肿瘤效果，我们利用反向遗传学技术将小鼠IL-7基因插入NDV非溶瘤株LX基因组中，构建了表达IL-7的重组新城疫病毒NDV-LX/(IL-7)。我们使用构建的重组NDV-LX/(IL-7)制备ATV-NDV-LX/(IL-7)确定与传统的ATV-NDV相比，ATV-NDV-LX/(IL-7)是否具有更好的抗肿瘤效果。方法：（1）利用反向遗传技术，构建表达红色荧光蛋白（RFP）的重组新城疫病毒NDV-LX/RFP以及表达小鼠白介素-7（IL-7）的重组新城疫病毒NDV-LX/(IL-7)。（2）体外检测两组重组新城疫病毒NDV-LX/RFP和NDV-LX/(IL-7)的生物学活性。用两株重组病毒制备ATV-NDV，体外检测其对小鼠淋巴细胞的激活以及对肿瘤细胞的特异性杀伤。（3）在肿瘤预防模型中，给小鼠皮下分别接种PBS，B16-F10自体肿瘤疫苗，表达RFP的重组新城疫病毒修饰的自体肿瘤疫苗NDV-LX/RFP以及表达IL-7的重组新城疫病毒修饰的自体肿瘤疫苗NDV-LX/(IL-7)，共接种两次，两次接种间隔14天，第二次疫苗接种后14天，小鼠皮下接种B16-F10肿瘤细胞，观察肿瘤生长情况，检测ATV-NDV-LX/(IL-7)的抗肿瘤效果，并通过流式染色以及细胞杀伤探究其抗肿瘤机制。（4）在肿瘤治疗模型中，给小鼠皮下接种B16-F10肿瘤细胞，构建小鼠黑色素瘤模型，7天后在小鼠对侧皮下分别接种PBS，B16-F10自体肿瘤疫苗，表达RFP的重组新城疫病毒修饰的自体肿瘤疫苗NDV-LX/RFP以及表达IL-7的重组新城疫病毒修饰的自体肿瘤疫苗NDV-LX/(IL-7)，每周两次，共接种两周，观察肿瘤生长情况，检测ATV-NDV-LX/(IL-7)的抗肿瘤效果，并通过流式染色以及细胞杀伤探究其抗肿瘤机制。（5）在肿瘤治疗实验中，处死小鼠3天前，给每只小鼠腹腔注射100ugEdU，3天后检测脾脏和肿瘤浸润淋巴细胞中EdU阳性的CD8+T细胞的比例，确定CD8+T细胞的增殖情况。（6）在肿瘤治疗实验中，在肿瘤接种后第二天，小鼠腹腔注射CD8中和抗体，清除小鼠体内CD8+T细胞，检测ATV-NDV-LX/(IL-7)对肿瘤治疗效果是否消失，以证明ATV-NDV-LX/(IL-7)对肿瘤的治疗效果是通过CD8+T细胞所介导的。结果：（1）成功构建了表达RFP以及IL-7的两株重组新城疫病毒NDV-LX/RFP以及NDV-LX/(IL-7)，感染细胞实验显示NDV-LX/RFP、NDV-LX/(IL-7)重组新城疫病毒为非溶瘤性病毒，ELISA测感染细胞上清，实验结果显示感染了NDV-LX/(IL-7)的肿瘤细胞上清中可以检测到高水平的IL-7的表达。（2）使用ATV-NDV-LX/(IL-7)体外刺激脾细胞，将刺激后的脾细胞对靶细胞进行杀伤实验，结果显示ATV-NDV-LX/(IL-7)可以显著提高小鼠脾细胞体外杀伤肿瘤的能力。（3）肿瘤预防组实验，结果显示使用ATV-NDV-LX/(IL-7)预先免疫小鼠，可以显著抑制肿瘤生长，流式染色以及计数结果显示，ATV-NDV-LX/(IL-7)组小鼠脾细胞中表达IFN-γ的CD8+T细胞比例以及总数显著高于对照组，并且ATV-NDV-LX/(IL-7)组小鼠脾细胞对肿瘤细胞的杀伤能力也显著高于对照组。（4）肿瘤治疗实验，使用ATV-NDV-LX/(IL-7)治疗荷瘤小鼠，结果显示ATV-NDV-LX/(IL-7)对肿瘤有着显著的治疗效果，流式染色以及计数结果显示，ATV-NDV-LX/(IL-7)组小鼠脾细胞中表达IFN-γ的CD8+T细胞比例以及总数显著高于对照组，肿瘤浸润淋巴细胞增多，肿瘤浸润淋巴细胞中表达IFN-γ的CD8+T细胞和CD4+T细胞比例以及总数显著高于对照组。（5）EdU检测细胞增殖实验中，发现ATV-NDV-LX/(IL-7)组小鼠与ATV-NDV-LX/RFP组小鼠相比，CD8+T细胞没有明显的扩增。（6）CD8+T细胞清除实验中，在清除了CD8+T细胞后，ATV-NDV-LX/(IL-7)组小鼠的抗肿瘤作用消失，肿瘤大小与对照组相比没有明显差异。结论：使用表达IL-7的重组新城疫病毒修饰的自体肿瘤疫苗，与传统的自体肿瘤疫苗以及新城疫病毒修饰的自体肿瘤疫苗相比，在肿瘤的预防以及治疗上有着更为显著的抗肿瘤作用，并且这一抗肿瘤作用是由CD8+T细胞所介导的。
【作者】梅雨；
【导师】刘海燕；
【作者基本信息】苏州大学，免疫学，2014，硕士
【关键词】ATV-NDV；IL-7；肿瘤免疫治疗；肿瘤疫苗；

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