PINK1基因通过线粒体分裂融合途径对脑缺血的神经保护作用

【摘要】近期有研究表明,线粒体分裂融合途径在缺血性神经元的损伤中扮演重要角色。我们的前期研究结果也表明,在缺血性刺激后,神经元内线粒体存在明显的过度断裂现象。而PINK1作为家族性帕金森病的致病基因,目前已有较多文献报导其参与了线粒体的分裂和融合过程,在哺乳动物细胞内,PINK1(PTEN-inducedputativekinase1)基因敲除可以诱导线粒体分裂以及片段化。为了探索PINK1在缺血性神经损伤中的作用,及其对缺血后神经元线粒体功能的影响。我们制备了氧糖剥夺(OGD)损伤的神经元模型,并采用慢病毒表达体系过表达野生型PINK1或其突变型L347p和W437x。并采用慢病毒介导的Pinkl-shRNA抑制内源性Pink1的表达。研究结果表明,PINKl能够明显减少改善OGD诱导细胞死亡、改善OGD后线粒体的形态和功能、减轻OGD后线粒体膜电位的衰减和能量代谢障碍。其保护作用可能是通过PINK1抑制了OGD诱导的线粒体分裂蛋白Drp1从胞浆向线粒体的细胞内转位,从而重建了线粒体分裂和融合的平衡有关。研究提示,PINK1可以通过抑制缺血性损伤诱导的线粒体分裂,从而达到改善线粒体功能和减少缺血性神经元死亡的作用。而对线粒体分裂融合途径的有效干预可能成为缺血损伤的神经保护研究靶点。第一部分PINK1对神经细胞缺血损伤的保护作用目的了解PINK1对于神经元OGD(Oxygenglucosedeprivation)损伤是否具有保护作用。方法培养原代神经元,构建野生型PINK1、突变型PINK1、以及Pink1-shRNA表达载体,对神经元内Pink1进行过表达以及敲除,Real-timePCI检测过表达及敲除效率。在OGD处理并复氧诱导神经元损伤后测定神经细胞损伤情况。结果成功培养原代神经元,构建各种PINK1表达载体并验证表达效率。OGD缺氧复氧诱导神经元损伤后,相比于对照组,过表达野生型PINK1可以减轻细胞损伤,而突变型和敲除Pink1后可以加重细胞损伤。结论PINK1基因对神经急性缺血损伤(OGD)具有神经保护作用。第二部分PINK1对神经细胞缺血损伤后线粒体形态和功能的作用目的研究PINK1对于神经元OGD(Oxygenglucosedeprivation)损伤后神经元线粒体形态和功能的作用。方法培养原代神经元,对神经元内PINK1进行野生型、突变型过表达以及敲除。在OGD处理后通过测定ATP以及线粒体膜电位评价线粒体损伤情况。Mito-dsRed标记线粒体后荧光显微镜下测量线粒体片段化程度以评估线粒体分裂融合情况。结果与对照组相比,OGD缺氧复氧诱导神经元损伤后,过表达野生型PINK1可以减轻线粒体损伤并且抑制线粒体片段化,而突变型和敲除PINK1可以加重线粒体线粒体的损伤和片段化。结论PINK1基因可以减轻OGD损伤导致的线粒体损伤和线粒体的片段化。第三部分PINK1通过线粒体分裂融合机制对神经细胞缺血损伤的保护作用目的研究PINK1在神经元OGD(Oxygenglucosedeprivation)损伤后抑制线粒体片段化发挥神经保护作用的机制。方法体外培养SH-SY-5Y细胞系,对神经元内PINK1进行野生型过表达以及敲除。在OGD处理后分离线粒体并WesternBlot测定线粒体分裂融合蛋白的含量。并且通过细胞免疫染色研究Drp1蛋白转位。结果与对照组相比,OGD缺氧复氧诱导神经元损伤后,过表达野生型PINK1可以抑制Drp1由胞浆向线粒体转位,使线粒体Drp1含量减少。而敲除Pink1可以加剧胞浆中Drp1向线粒体转位,增加线粒体的nrpl含量。结论PINK1可以通过抑制Drp1由胞浆向线粒体转位,使线粒体Drp1含量减少,从而减轻线粒体的片段化,起到改善线粒体功能和神经保护的作用。结论1.PINK基因对于神经缺血损伤具有保护作用。这种保护作用与神经细胞的线粒体功能有关,这种保护作用的发挥与PINK1蛋白胞浆段的激酶活性相关。2.OGD损伤后线粒体的片段化增强,是由于线粒体Drp1的增多引起的。PINK1可以在OGD损伤后通过减少胞浆中的Drp1向线粒体转位,从而减少线粒体的nrp1,抑制神经元中线粒体的片段化从而发挥神经保护作用。
【作者】陈方哲；
【导师】董强；
【作者基本信息】复旦大学，临床医学（专业学位），2013，博士
【关键词】PINK1；线粒体；分裂融合；Drp1；糖氧剥夺模型(OGD)；神经保护；

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