MiR-124的靶基因Capn4在胶质瘤的表达和意义及其相关分子机制研究

【摘要】[目的]检测Capn4在脑正常组织、胶质瘤旁组织和各类胶质瘤组织的表达情况,分析Capn4在各类胶质瘤中的表达是否差异；建立Anti-capn4胶质瘤细胞系,对其细胞功能学进行研究。分析capn4在胶质母细胞瘤中的表达水平,明确Capn4对胶质母细胞瘤的患者是否具有预后意义；检验Capn4是否为miRNA-124的靶基因；[方法]通过免疫组化和组织芯片检测300例脑外伤组织、胶质瘤旁组织和各类胶质瘤组织的表达情况,统计学分析脑正常组织和胶质瘤中Capn4的表达是否存在差异以及各类胶质瘤Capn4表达情况与其恶性程度的相关性。选择U251胶质母细胞瘤细胞系,通过病毒质粒转染anti-capn4的发夹RNA(shRNA-Capn4)进入U251胶质母细胞瘤细胞系,并建立稳定的shRNA-Capn4-U251细胞系作为实验组；对照组通过转染空白病毒质粒进入U251胶质母细胞瘤细胞瘤,并建立稳定的eGFP-U251细胞系。运用逆转录实时定量PCR和WesternBlotting检测实验组和对照组Capn4的mRNA和蛋白的表达水平,确认shRNA-capn4-U251细胞系Capn4呈低表达水平。通过细胞功能学试验(划痕试验、Transwell、MTT)检测对照组eGFP-U251细胞系,空白对照组U251细胞系和实验组shRNA-Capn4-U251细胞系的细胞迁移能力、侵袭能力和增殖能力,通过比较三组之间的细胞生物学特征的差异,明确capn4对胶质瘤细胞的生物学行为的影响。用免疫组化观察94例胶质母细胞瘤患者石蜡切片Capn4的表达情况；随访患者的临床资料；通过SPSSv19.0软件分析(Kaplan-Meier单因素分析和Cox多因素回归分析)94例GBM患者的OS、PFS与capn4高表达/低表达的关系。通过miRNA预测网站(TargetScan:http://www.targetscan.org/;microRNA.org;http://www.microrna.org/)寻找miR124的靶基因时发现,Capn4可能是调节胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的miRNA-124的候选靶基因之一。通过体外模型转染miR-124后,检测U251-miRNA-124组细胞系和对照组细胞系的Capn4的mRNA和蛋白的水平,以验证Capn4是否为miR-124的靶基因。[结果]在组织芯片的300例样本中,正常脑组织/肿瘤旁组织Capn4阳性率显著低于胶质瘤组织Capn4阳性率(p<0.001)；在星形细胞来源的胶质瘤中,高级别胶质瘤细胞Capn4阳性率显著高于低级别胶质瘤Capn4阳性率(p<0.001)。通过下调Capn4表达水平,U251细胞系的迁移、侵袭能力下调,增殖能力未受到明显影响。在94GBM样本中,Capn4高表达的有52例(55%),低表达的有42例(45%)。Capn4高表达的GBM患者的在总生存时间(单因素分析p=0.032；多因素分析p=0.048,HR=1.541,95%CI:1.004-2.055;)和无进展生存时间(单因素分析p=0.038；多因素分析p=0.019,HR=2.23495%CI:1.151-4.757)上短于Capn4低表达的患者,具有统计学差异。通过转染miR-124后,U251细胞系的miR-124表达水平明显上调,同时通过RT-qPCR和Westernblotting验证Capn4的mRNA和蛋白水平显著性下调,证实Capn4是miR-124的靶基因。[结论]Capn4是miR-124的靶基因之一。Capn4高表达在胶质瘤中(特别是高级别胶质瘤)常见,并且提示GBM患者预后不佳,可能作为GBM的候选的负性预后生物学标记。下调Capn4表达水平,可调节胶质瘤细胞的迁移、侵袭能力。Capn4在胶质瘤治疗策略中可能作为新的靶点。
【作者】蔡加君；
【导师】毛颖；
【作者基本信息】复旦大学，临床医学（专业学位），2013，博士
【关键词】胶质瘤；胶质母细胞瘤(GBM)；Capn4；miR-124；预后；

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