CARM1对胚胎造血以及胸腺细胞发育的调节

【摘要】前言造血干细胞的自我更新以及全能分化的能力持续终身。表观遗传修饰能够促进细胞分化。因为细胞分化前后的遗传信息不同,DNA甲基化和组蛋白甲基化等表观修饰对于细胞分化保持在某一状态必不可少。表观遗传机制如同铰链般控制定向分化,但是一般来说对去分化却不起这样的作用。一些小分子表观遗传调节蛋白,以及一些特殊基因的过表达,可以作为影响细胞分化的可塑性元件。当这些因素被逆转,会导致细胞进入iPS(inducedpluripotentstem)全能分化状态。由此,造血干细胞的分化过程可能是研究表观遗传改变的最好的生物学系统。近期研究对DNA的甲基化模式的研究表明在造血过程中每一个时期,每个亚群细胞定向中存在其特殊的甲基化形式。同DNA甲基化一样,大量相关研究表明精氨酸甲基化在淋巴细胞分化和信号转导中作用同样重要。作为一种常见的转录后修饰,精氨酸的甲基化往往改变其底物的生物学作用,其机理如下：1)为含Tudor结构的效应因子(effectotmolecules)提供了锚dockingsite[7.8.9.10];2)阻断蛋白-蛋白相互作用,如某些SH3结构介导的相互作用；3)对AKT介导的磷酸化的负调节作用,因为AKT序列含有氨基酸残基；4)阻断赖氨酸甲基化。在胞浆和胞核中都有蛋白质精氨酸甲基化酶(argininemethyltransfe-rases,PRMTs)的底物存在,组蛋白是胞核中的一种非常重要的底物。PRMTs催化的组蛋白甲基化是转变细胞命运的表观遗传密码的主要成因。哺乳动物PRMT酶家族有九个成员,分别是PRMT1-9。大多数成员都作用于组蛋白H3的N端,组蛋白4(H4),以及组蛋白2A(H2A)。CARM1/PRMT4是这个家族中第一个被发现有转录辅激活因子功能的成员,其作用于H4R17,H3R26,以及其他转录调节因子。前期研究表明CARM1Knockout小鼠胚胎比野生型小,出生后无法正常呼吸,即刻死亡。对于该动物模型的研究已经表明若干表型的存在,大部分与细胞分化相关。CARM1Knockout出生致死性与肺泡Ⅱ型上皮细胞过多导致肺泡Ⅰ型上皮细胞发育不全有关。由此,CARM1在正常肺泡细胞分化中有重要作用。CARM1Knockout小鼠缺乏棕色脂肪,相关研究发现CARM1null细胞不能分化成脂细胞。CARM1在软骨发生以及骨骼肌发育中作用相当重要,对于维持正常胚胎T细胞数量及分化有重要作用。综上,CARM1活性在多个器官包括肺,脂肪,肌肉,软骨以及胸腺细胞中有不可或缺的作用。本课题将进一步探索CARM1Knockout小鼠模型的免疫系统表型,CARM1在胸腺细胞发育中的作用,及其产生的机制。第一部分敲除CARM1基因对小鼠淋巴细胞发育的影响目的观察敲除CARM1基因对小鼠胸腺细胞发育造成的影响。方法通过同系繁殖(CARAi+/-小鼠,培育CARM1-/-胚胎；SouthernBlot及PCR验证小鼠基因型；通过细胞计数及流式细胞分析技术,根据细胞表面标志物不同,区分不同亚群,获得各个亚群的信息,分析胸腺细胞。结果验证小鼠体内CARM1基因被成功敲除；CARM1基因敲除鼠身长显著小于野生型,仅为对照的60%大小；CARM1基因敲除鼠的胸腺亦显著小于对照；CARM1-胸腺细胞数显著少于对照；CARM1-/-胸腺中,DN1细胞数量与对照相近,但DN2,DN3,DN4均减少90%,CD4SP,CD8SP减少75%,yδT细胞数量显著减少85%。小结验证小鼠体内CARM1基因确被敲除；验证胚胎表型,包括胚胎长度为对照60%,胸腺发育不全,存在DN1-DN2发育阻滞。第二部分CAR1-/-小鼠胚胎中胸腺细胞发育缺陷与胸腺上皮细胞的关系目的鉴于胸腺细胞发育与胸腺上皮细胞(TEC)联系密切,探讨CARM1-/-小鼠胸腺发育不全是否有胸腺上皮细胞中缺乏CARM1引起。方法培育CARM1-/-胚胎,免疫荧光化学及流式细胞术检测E18.5胸腺上皮细胞各组分的分布；构建肾包膜下同种异体胸腺移植模型,分别将去除胸腺细胞的胸腺上皮组织,植入先天性无胸腺却有来自骨髓的正常胸腺前T细胞的受体裸鼠体内,6-8周后处死小鼠,流式细胞术检测胸腺细胞各个组分是否重建。结果免疫应光化学显示：E12.5,E13.5胸腺K5/K8染色中,CARM1-/-胸腺明显小于同龄对照,但其皮质髓质分布形式未见异常；E18.5流式细胞术显示CARM1-/-胸腺其内皮质细胞(MHCII+Ly51+)及髓质细胞(MHCII+UEA+)的绝对数量与对照接近,未见异常；及成功构建肾下囊同种异体胸腺移植模型后胸腺细胞得以重建,虽然CARM1-/-数量较对照稍少,但其比例未见异常。小结虽然CARM1-/–胸腺小于对照,但是其皮髓质分布正常；据流式细胞术,其皮质和髓质细胞绝对数量未见减少；肾下囊同种异体胸腺移植动物模型的建立后相关分析显示CARM1-/-胸腺上皮细胞能够支持正常前T细胞的发育,因此CARM1-/-小鼠的胸腺上皮细胞数量及功能未见异常,即CARM1-/-小鼠胚胎中胸腺细胞发育缺陷并非由胸腺上皮细胞引起。第三部分CARM1造血过程中的影响目的观察CARM1基因敲除后对小鼠胚胎造血过程的影响,追溯其胸腺细胞数目减少最早发生时间,探讨CARM1-/-胸腺发育细胞发育阻滞,数量减少的原因,是否由其上游干细胞的缺陷引起。方法培育CARM1-/-还胎,免疫荧光化学及流式细胞术检测不同胎龄CARMl-/-胸腺中早期造血祖细胞的数量；竞争性重建实验：Actin-GFP小鼠与CARM1+/-杂交获得GFP+CARMl+/小鼠后,同系繁殖获得GFP+CARM-/-胚胎,混合相同数量的GFP+CARMl-/-与GFP-CARMl+/-胸腺细胞,眼眶后静脉注射至受体鼠,6-8周后处死受体小鼠,流式细胞术分析其胸腺,外周淋巴细胞各组分是否有效重建。结果1.CARM1-/-E12.5CD45+造血祖细胞数目显著减少,cKit+CD25+染色,显示早期胸腺细胞减少改变延续E13.5乃至E17.5,持续整个胚胎期；2.CARM1-/-骨髓细胞总数显著减少,KLS亚群的比例和绝对细胞数显著减少；F1k2+MPP减少了95%,LT-HSC和ST-HSC分别减少大约80%；下游的定向分化祖细胞也受波及,1ineage1℃D27+Flk2+亚群亚群数量减少93％.CD27+F1k2+亚群减少85%,CMP和MEP明显减少分别达92%和66%,GMP未受影响；3.与骨髓相反,E18.5CARM1-/-胚胎肝脏的总细胞数与对照接近,无显著差异；CARM1-/-LT-HSC的数量略为升高,进而总KLS细胞量略高。其他所有造血祖细胞数量没有显著差异。4.E14.5GFP+CARM1-/-胚胎肝脏细胞整体细胞数目未见显著减少,且KLS亚群的比例及比例及绝对数量未见差异；5.竞争性重建实验表明,与Calm+/+干细胞相比,Carml-/-重建的DN1至CD4SP或CD8SP各个亚群均大幅度减少。在同样的竞争条件下,Carml-/-干细胞分化产生的各亚群细胞,MEP除外,远少于Carm1+/+干细胞。小结CARM1-/-骨髓细胞LT-HSC及其引起的CLP减少,印证E18.5CARM1-/-观察到的胸腺细胞和脾B细胞的减少。由此,CARM1对于造血早期以及随后的淋巴分化不可或缺,但是未受影响的GMP亚群反应CARM1缺失并不影响迟些的髓系分化。E18.5CARM1-/-胚胎肝脏的总细胞数未见异常,LT-HSC及KLS细胞量略高,其他造血祖细胞数量未见差异,提示CARM1对于维持胚胎肝脏中造血祖细胞的数量并非必要。竞争性重建实验反映Carm1-/-干细胞造血能力显著弱于Carm+/+干细胞。虽然在E14.5CARM1-/-胚胎肝脏中存在与对照无显著差异数量的造血干细胞,但其造血能力因CARM1基因敲除严重受损。鉴于受体RAG2-/-γc-/-鼠体内微环境CARM1并未敲除,造血干细胞中内源性CARM1在造血过程中必不可少。结论1.验证小鼠体内CARM1基因确被敲除；验证胚胎表型包括胚胎长度为对照60%,胸腺发育不全,存在DN1-DN2发育阻滞.2.CARMl-/-胸腺皮髓质分布正常；绝对数量未见减少；肾下囊同种异体胸腺移植动物模型的建立后相关分析显示CARM1-/-胸腺上皮细胞能够支持正常前T细胞的发育,CARM1-/-小鼠胚胎中胸腺细胞发育缺陷并非由胸腺上皮细胞引起。3.CARM1-/-骨髓细胞LT-HSC及其引起的CLP减少,与E18.5CARM1-/-观察到的胸腺细胞和脾B细胞的减少呼应。CARM1对于造血早期以及随后的淋巴分化不可或缺,但是未受影响的GMP亚群反应CARM1缺失并不影响髓系分化。4.E18.5CARM1-/-胚胎肝脏的总细胞数未见异常,LT-HSCs及KLS细胞量略高,其他造血祖细胞数量未见差异,提示CARM1对于维持胚胎肝脏中造血祖细胞的数量并非必要。5.竞争性重建实验结果反映同等条件下,Carm1-/-干细胞造血能力显著弱于Carm+/+干细胞,E14.5CARM1-/-胚胎肝脏造血干细胞的造血能力因CARM1基因敲除严重受损。6.鉴于受体RAG2-/-γc-/-鼠体内微环境CARM1并未敲除,造血干细胞中内源性CARM1在造血过程中必不可少。
【作者】李佳；
【导师】赵子琴；
【作者基本信息】复旦大学，法医病理学，2011，博士
【关键词】CARM1；胸腺细胞；胸腺上皮细胞(TEC)；造血干细胞(HSC)；肾下囊同种异体移植；竞争性重建实验；

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