脑动静脉畸形Notch信号通路的差异表达及NCEx在脑出血鼠与缺氧HBVEC的表达研究

【摘要】第一部分Notch信号通路基因在人脑动静脉畸形和周围脑组织中的差异表达目的：应用基因芯片研究人脑动静脉畸形(brainarteriovenousmalformations,BAVM)畸形团及周围脑组织的Notch信号通路相关基因的差异表达。方法：收集有出血史的5例脑动静脉畸形,在畸形团、周围脑组织分别取材,进行Notch信号通路基因芯片杂交,得到基因芯片上各基因点数值型信号强度,计算其均数和标准差。计算畸形团芯片及周围脑组织芯片上各基因点的比值。取比值大于1.5或小于0.67的因子,归纳总结出表达水平有明显差异的基因。以realtimePCR方法对其中任意选取的2个基因进行验证。结果：在113个Notch信号通路基因中,共筛选出27个明显变化的基因,其中,上调的4个,下调的23个。较为重要的基因包括：Notch信号通路配体DLL1、DLL3,受体及配体裂解关键基因ADAM10、ADAM17,Notch信号通路靶基因HES5,Notch相关的SonicHedgehog通路基因GLI1、Wnt信号通路基因FZD1、原癌基因LM02。realtimePCR验证DLL1和HES5两个基因,其检测结果与芯片结果基本相符。部分Notch信号通路关键基因在两个部位表达无差异。结论：多个Notch信号通路基因在BAVM畸形团及周围脑组织存在差异表达,提示BAVM的发生发展与Notch信号通路有关。周围脑组织中,Notch信号通路亦可能存在异常。差异表达的基因可作为BAVM进一步研究的切入点。第二部分新型钠钙交换蛋白NCEx等在大鼠脑出血模型中的表达变化目的：观察新型钠钙交换蛋白NCEx、糖代谢相关蛋白-1(glucosemetabolismrelatedprotein-1,GMRP-1、细胞内钙离子浓度、Notch信号通路相关基因在大鼠脑出血模型中的表达变化,初步探讨细胞内钙离子浓度、NCEx与Notch信号通路的关系。方法：建立大鼠自发性脑出血模型(EICH)后,进行四部分实验。1、realtimePCR法、Westernblot法检测造模后6h、1天、3天、5天、7天各时间点出血侧及对侧尾状核、对照组右侧尾状核NCExmRNA及蛋白表达水平；免疫组化法分析造模后6h、3天、7天各时间点出血侧及对侧尾状核、对照组右侧尾状核NCEx表达的形态学。2、Westernblot法检测造模后6h、1天、3天、5天、7天各时间点出血侧及对侧尾状核、对照组右侧尾状核GMRP-1蛋白表达水平。3、Fura-2/AM负载双波长荧光分光光度计法检测造模后6h、1天、3天、5天、7天出血侧及对照组右侧尾状核细胞内钙离子浓度。4、realtimePCR法测定造模后6h、3天、7天各时间点出血侧及对照组右侧尾状核Notch4和ADAM10mRNA表达水平。结果：1、正常情况下,NCExmRNA在大鼠尾状核有一定量表达。在自发性脑出血模型造模后6小时,NCExmRNA表达水平即下降；至造模后3天,其表达水平降至最低；造模后7天,表达水平回复至正常水平。造模后每个时间点,出血侧NCExmRNA的表达水平,都低于未出血侧。造模后3天时,与对侧相比,NCEx基因表达下降3倍。Westernblot的结果与realtimePCR法检测结果相符。免疫组化显示自发性脑出血模型造模后各时间点,NCEx的染色都较正常组染色浅,且稀疏。染色最浅及稀疏的是造模后6h。造模后每个时间点,同对侧相比,NCEx的染色都较浅及稀疏。2、GMRP-1蛋白在正常大鼠尾状核有一定量表达。自发性脑出血模型造模后6小时,GMRP-1蛋白表达水平即下降；造模后第1至5天表达水平降至最低；造模后7天,表达水平复又升高。造模后各时间点,出血侧GMRP-1蛋白的表达水平都低于对侧；造模后第7天的表达水平同对侧的差别无统计意义。造模后1天时,与对侧相比,GMRP-1表达下降4倍左右。3、测得正常情况下尾状核细胞内钙离子浓度为(277.1±22.0)nmol/L。造模后6小时,胞内钙离子浓度即升高；造模后第3天,胞内钙离子浓度水平达(887.5±52.2)nmol/L,为正常值的3倍余；此后,水平开始下降。胞内钙离子浓度和NCEx蛋白表达量的相关系数r=0.66(P<0.05)。4、正常情况下,ADAM10mRNA及Notch4mRNA在大鼠尾状核有一定量表达。在自发性脑出血模型造模后6小时,两者的表达水平即降至最低；造模后3天,表达水平开始升高；造模后7天,表达量高于正常水平。结论：调节胞内钙离子浓度的NCEx、调控细胞凋亡与增殖的GMRP-1、调控细胞及组织新生、分化与重构的Notch信号通路因子Notch4和ADAM10在脑出血后呈现一定的变化规律。NCEx的表达水平和胞内钙离子浓度相关。NCEx、GMRP-1、Notch信号通路的动态表达水平,表明三者可能参与脑出血后早期钙超载引起的细胞功能障碍、细胞的凋亡及后期细胞与组织的新生、增殖与重构。第三部分NCEx在缺氧培养人脑血管内皮细胞的表达研究目的：通过研究缺氧培养的人脑血管内皮细胞(Humanbrainvascularendothelialcells,HBVEC)中NCEx的异常表达及细胞内钙离子浓度测定,初步探索缺氧、NCEx、胞内钙离子浓度和血管内皮功能异常之间的关系。方法：复苏HBVEC并传代培养后,将细胞分为缺氧培养组及正常培养组,前者置于无氧培养箱中以普通培养基培养24小时,后者以普通培养条件培养。分别以Westernblot法检测NCEx蛋白含量和Fura-2/AM负载双波长荧光分光光度计法检测胞内钙离子浓度。结果：HBVEC成功复苏并传代。缺氧培养24小时,HBVEC漂浮死亡的细胞较少。正常培养的HBVEC表达一定量的NCEx;缺氧培养24h后,HBVEC的NCEx表达明显降低,为正常情况下表达量的0.16倍。缺氧培养24h后,细胞内钙离子浓度升高至2.2倍。结论：普通培养液无氧培养箱中培养24h制作内皮细胞缺氧损伤模型切实可靠。缺氧可使HBVEC的NCExmRNA表达下调,并使胞内钙离子浓度升高。两者水平的变化可能有关。
【作者】郑名哲；
【导师】陈衔城；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2011，博士
【关键词】脑动静脉畸形；Notch；基因芯片；NCEx；钙离子；GMRP-1；脑出血；缺氧；HBVEC；

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