甘薯GGDS基因克隆及功能分析

【摘要】甘薯在发展中国家最重要的粮食作物中排名第五,仅次于水稻,小麦,玉米和木薯。很多研究表明甘薯是最健康的食物,因为其富含多种复杂的碳水化合物,抗氧化的花色素苷和多种类胡萝卜素等。甘薯薯块的颜色有白色,黄色,紫色和橘色等,但是只有橘色品种的甘薯才含有丰富的维他命A的前体物质β-胡萝卜素。事实上,橘色品种的甘薯在非洲和东南亚的不发达国家是人们获得p-胡萝卜素的主要来源。然而,甘薯中的p-胡萝卜素含量远远低于人类生理活动的正常需求,这将会导致一系列的维他命A缺乏症,比如干眼症,角膜病变,角膜软化,有的甚至导致死亡。所以提高甘薯中p-胡萝卜素的含量有着重要意义。基于甘薯中类胡萝卜素生物合成途径的分子和生物化学水平通过基因工程手段改造p-胡萝卜素代谢途径来提高甘薯中p-胡萝卜素含量是可行的方法之一。类胡萝卜素合成机制在果实和花中已经被普遍研究,但是很少在地下根组织中研究。20碳的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸是一种一系列物质的普遍前体,这些物质包括：β-胡萝卜素,叶绿素,植物激素(ABA和GA),叶绿醌,生育酚等。牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶(GGDS)催化异戊二烯二磷酸和二甲基丙烯基二磷酸合成牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(GGDP)。本研究从甘薯中克隆得到了类胡萝卜素合成途径中的一个异戊烯基转移酶基因(IbGGDS,GenBank登录号：KF991091),并对其进行生物信息学分析,结果表明,该基因cDNA全长1409bp,其中包含了一个1092bp的开放阅读框,编码一个含363个氨基酸残基的多肽。通过氨基酸序列多重比对发现该基因的氨基酸序列和预测的蛋白结构和已经报道的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶(GGDS)和牻牛儿基二磷酸合成酶(GPPS)的一个大亚基高度相似。IbGGDS的N端有一个63个氨基酸的质体转运肽。将核心编码区的1092bp核苷酸序列以及编码质体转运肽的189bp核苷酸序列构建亚细胞定位载体,转化烟草的原生质体。在激光共聚焦显微镜下观察到IbGGDS蛋白及其质体转运肽确实使GFP转运到叶绿体。IbGGDS的质体定位证明了该基因编码蛋白质定位于合成p-胡萝卜素的场所-质体。用切去质体转运肽的IbGGDS在大肠杆菌中重建p-胡萝卜素代谢途径,含有IbGGDS的工程菌因为生产类胡萝卜素而变成黄色。这就证明了IbGGDS编码的酶具有合成牻牛儿基牻牛儿基二磷酸的功能。最后,本研究采用qPCR的方法对IbGGDS和其下游五个p-胡萝卜素合成途径基因包括PSY、PDS、ZDS、crtISO和LYCB在橘黄色薯块的甘薯块根、须根、成熟叶片、幼嫩叶片、成熟茎、幼嫩茎、成熟叶柄这七个组织的相对表达量分析,就IbGGDS来说,在块根中的相对表达量分别比须根、成熟茎、成熟叶柄、成熟叶、幼嫩叶和幼嫩茎高18、25、18、4、5和14倍。PSY是p-胡萝卜素途径上的第一个关键酶,LYCB是p-胡萝卜素途径上的最后一个关键酶。PSY在块根中的相对表达量分别比须根、成熟茎、成熟叶柄、成熟叶片、幼嫩叶片和幼嫩茎高618、898、93、88、22和648倍,LYCB在块根中的相对表达量分别比须根、成熟茎、成熟叶柄、成熟叶片、幼嫩叶片和幼嫩茎高167、45、42、15、8和49倍。结果表明IbGGDS、PSY、PDS、ZDS、crtISO和LYCB都是在块根中特异表达,基因表达分析结果表明甘薯地下块根是p-胡萝卜素生物合成的主要器官。通过HPLC的方法对相应组织的p-胡萝卜素含量进行分析发现,成熟叶片中的p-胡萝卜素含量为1.72±0.059mg/gFW,幼嫩叶片中p-胡萝卜素含量为1.13±0.034mg/gFW,分别比块根中的含量(0.19±0.020mg/gFW)高了9.11倍和5.98倍。须根中检测到少量的p-胡萝卜素(0.06±0.002mg/gFW),成熟叶柄和成熟茎中只能检测到微量的p-胡萝卜素(分别为0.015±0.002mg/gFW和0.008±±0.001mg/gFW).有意思的是,成熟叶片和幼嫩叶片中p一胡萝卜素含量远远高于块根,甘薯叶片是p-胡萝卜素的主要储存器官。本研究推测p-胡萝卜素在甘薯的块根中合成后通过某种转运机制运输到叶片中储存。本研究证实了克隆得到的IbGGDS的确是p-胡萝卜素合成途径中的GGDS基因,对甘薯GGDS基因的研究对利用基因工程手段调节甘薯类胡萝卜素合成途径有重要意义。
【作者】马丽利；
【导师】廖志华；
【作者基本信息】西南大学，植物学，2014，硕士
【关键词】甘薯；牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶；功能分析；β-胡萝卜素；

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