PEI/pDCN纳米复合物治疗大鼠Thy-1肾炎实验研究

【摘要】前言肾小球硬化是各种肾小球疾病进展的共同结局,其重要物质基础是肾小球内细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的大量沉积。研究表明：转化生长因子-β1(TGF-β1)可以促进肾小球系膜细胞(MC)合成ECM,影响基质降解酶及其抑制剂的合成、分泌及整合素的表达,是肾小球硬化的重要影响因子。饰胶蛋白聚糖(decorin,DCN)是一种富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖,在ECM合成、组成和细胞生长调控等方面发挥重要作用。研究证实：DCN可以中和TGF-β1的活性,被认为是TGF-β1的负反馈调节因子。我们的前期研究也发现：DCN的过表达不仅抑制MC系膜细胞TGF-β1ColIV的表达,而且参与调控MC的生长和凋亡。因此DCN是一个很有应用前景的防治肾小球疾病的细胞因子。基因治疗作为一种有潜力的疾病治疗手段,越来越多的被研究工作者所关注。聚乙烯亚胺是(PEI)一种阳离子有机聚合物,为研究应用最广的非病毒基因载体之一。PEI是一种高水溶性有机聚合物,它每隔2个碳原子就有一个氮原子,在生理条件下,大约20%的氮原子发生质子化,因此表面带有大量正电荷,可以通过静电作用和带负电的质粒DNA(pDNA)结合,并且能压缩、包裹质粒形成稳定的纳米复合物。PEI作为基因载体具有较高的转染效率,较低的毒性,无免疫原性,易于修饰等优点,已经成功的被运用到体内体外的许多实验。本课题利用静电作用合成PEI/pDCN纳米复合物,体外转染MC,经(3418筛选,挑选出稳定高表达DCN蛋白的稳转克隆,并利用MC回输肾脏后可定居于肾小球系膜区的特性,把稳转克隆经左肾动脉回输到大鼠Thy-1肾炎动物模型肾内,观察分泌的DCN对肾小球MC增生和ECM沉积的抑制作用。同时,细胞学实验也验证了DCN的过表达对TGF-β1和ColⅣ的拮抗作用,和对MC生长的调控。通过本课题的研究,为肾小球疾病的纳米基因治疗提供新的实验依据。第一部分PEI/pDCN纳米复合物的合成、转染及对大鼠肾MC生长的影响目的合成PEI/pDCN纳米复合物,体外稳定转染MC并探讨DCN过表达对大鼠MC的影响。方法混合带正电荷的PEI和带负电荷的质粒,通过自发的静电作用可以形成稳定的纳米复合物子；由于不同的N/P比值会影响到纳米复合物的转染效率,所以先以EGFP质粒为报告基因,体外转染MC,选出最佳的N/P比值,以此比值再合成PEI/pDCN纳米复合物,转染MC,用G418筛选阳性细胞克隆,用Westernblot方法检测,选出DCN高表达的稳转细胞克隆,进行细胞学实验及后续的动物实验；用Westernblot方法,检测DCN过表达对系膜细胞IV型胶原和TGF-β1的蛋白表达；应用流式细胞仪检测细胞周期。结果用NicompTM380粒径分析仪测定合成的PEI/pDCN纳米复合物粒径在146±70.91nm到151.7±72.43nm之间；不同的N：P比例合成的PEI/pEGFP纳米复合物转染MC,在N/P比值为20：1的条件下转染效率最高,和商品化的脂质体转染试剂的转染效率相近；以此比例合成PEI/pDCN纳米复合物,转染MC,经G418筛选、Westernblot鉴定,选出稳定表达DCN的稳转克隆D6；稳定转染pcDNA3.1A-DCN质粒可上调MC内DCN蛋白表达,降低ColIV和TGF-β1的蛋白表达水平,并且使Go/G1期的细胞数明显增多,S期的细胞数减少,提示MC生长受到抑制。小结通过自发的静电作用PEI和质粒DNA合成纳米复合物,可以在体外转染MC,并且能获得稳定高表达DCN基因的MC株(D6)。DCN参与调控MC的生长,且可有效调节MC内TGF-β1和ColIV的蛋白表达。第二部分肾动脉回输PEI/pDCN纳米复合物稳定转染的MC对大鼠Thy-1肾炎的治疗作用目的明确回输稳定表达DCN的MC对大鼠Thy-1肾炎的治疗作用方法提取大鼠胸腺细胞免疫兔子制备ATS,免疫荧光法检测其效价；通过SD大鼠的尾静脉注射复制大鼠Thy-1肾炎模型；建立PEI/pEGFP内米复合物稳定转染MC,然后通过左肾动脉回输稳转细胞,进而明确回输细胞在大鼠肾脏内的定位；经左肾动脉回输稳转细胞克隆D6到Thy-1肾炎模型鼠的左侧肾脏,然后用免疫组化检测相关指标,明确回输的D6对肾小球疾病的影响。结果成功制备大鼠ATS抗血清,并成功复制大鼠Thy-1肾炎模型。回输细胞在肾小球中的定位：左肾约65±2.13%肾小球成阳性表达,回输细胞主要定位于肾小球毛细血管和肾系膜区。回输D6稳转细胞能在肾小球内表达DCN蛋白,在回输第3天,DCN的蛋白表达量最高。在大鼠Thy-1肾炎模型中,回输稳定表达DNC蛋白的D6克隆,可影响肾小球病变,降低ColIV和PCNA的表达。小结通过制备ATS抗血清,成功复制大鼠Thy-1肾炎模型；经左肾动脉成功回输稳转MC到大鼠肾脏,并明确其定位于肾小球；回输的D6稳转细胞能在肾小球内表达DCN蛋白；在大鼠Thy-1肾炎模型中,与对侧肾相比较,回输肾的肾小球病变,包括PCNA和ColIV的表达均有不同程度的降低。
【作者】孙建永；
【导师】张志刚；
【作者基本信息】复旦大学，病理学，2011，博士
【关键词】大鼠系膜细胞；ECM；聚乙烯亚胺；ATS；Thy-1肾炎；TGF-β1；基因治疗；纳米复合物子；

【参考文献】
[1]张浩.证券快速订单处理系统的设计与实现[D].复旦大学,软件工程,2012,硕士.
[2]孙晓琳.非公企业党建工作探究[D].山西师范大学,马克思主义理论,2013,硕士.
[3]刘晓媛.甘肃演艺集团公司发展战略研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[4]江华.城乡统筹背景下成都农村聚居点选址评价研究[D].西南交通大学,景观工程,2013,硕士.
[5]赵春会.锦纶经编增强橡胶复合材料的制备及力学性能研究[D].东华大学,纺织工程（专业学位）,2014,硕士.
[6]刘明刚.MapReduce故障容错研究与作业调度器优化[D].杭州电子科技大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[7]赵翔.基于信任机制的多Agent系统协同研究[D].北京交通大学,2010.
[8]张德林.中国石油天然气总公司地震勘探技术经验交流会在涿州召开[J].石油地球物理勘探,1991,06:796.
[9]边立辉.控制权转移对上市公司并购绩效的影响研究[D].河北经贸大学,会计学,2012,硕士.
[10]陆岩.地下商业建筑公共交通空间研究[D].大连理工大学,建筑设计及其理论,2003,硕士.
[11]何新.Bussgang盲反卷积算法及其应用研究[D].哈尔滨工业大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[12]张红艳,林舒,沙玫.羧基功能化石墨烯修饰电极伏安法对芦丁的检测研究[J].辽宁中医药大学学报,2013,06:35-37.
[13]李昆.多先验模型协作及图像复原方法研究[D].哈尔滨工业大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[14]刘鑫.节能技术在绿色建筑工程中的应用研究[D].吉林大学,项目管理,2014,硕士.
[15]刘影.网络交易税收管理法律问题研究[D].吉林财经大学,法律,2014,硕士.
[16]高媛.西安高新技术产业开发区政府治理模式研究[D].延安大学,行政管理,2014,硕士.
[17]胡潇潇.毒砂与酸性溶液的水矿表界面反应机制研究[D].南京大学,矿物学、岩石学、矿床学,2013,硕士.
[18]刘晓光.神华黄骅港定位车系统改造[D].燕山大学,机械工程,2012,硕士.
[19]汪娟娟.钆配合物修饰的四氧化三锰纳米粒子的制备及其在核磁共振成像中的应用[D].上海师范大学,无机化学,2013,硕士.
[20]吕保敬.某品牌汽车消费者对制动系统报怨行为的分类研究及营销启示[D].华东理工大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[21]李相芝.基于网络的个别化学习探讨[D].华中师范大学,2004.
[22]王金淑,田恬,刘伟,赖陈,周帆,赵雷.铼掺杂对含钪阴极性能与微观结构的影响[J].北京工业大学学报,2015,04:481-485.
[23]柴晓花.人工巢箱条件下红隼雌鸟和雏鸟行为研究[D].东北师范大学,动物学,2012,硕士.
[24]李金艳.概念图在初中英语阅读教学中的应用研究[D].首都师范大学,学科教学,2013,硕士.
[25]张荣强.网络购物伦理研究[D].湖南工业大学,伦理学,2012,硕士.
[26]任琳琳.流式影像术在黄东海浮游植物群落结构研究中的应用[D].中国科学院研究生院（海洋研究所）,环境工程,2013,硕士.
[27]包继旺,席与珩,刘荔.电力企业压力容器可视化动态监督管理系统[J].电力系统自动化,2007,04:105-107.
[28]杨勤凯.LTE下行资源调度优化算法研究[D].哈尔滨工业大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[29]宋素琴.新疆无叶假木贼抗菌活性物质的初步研究[D].中国农业大学,植物病理学,2004,硕士.
[30]李婵娟.金属钛夹在肠巨大息肉切除术及ESD中的应用[D].大连医科大学,内科学,2012,硕士.
[31]陈伊萍.论杂糅性在布莱恩·卡斯特罗的小说《上海舞》中的体现[D].内蒙古大学,英语语言文学,2014,硕士.
[32]汪荣贵,张佑生,彭青松.分组样本下Bayes网络条件概率的学习算法[J].小型微型计算机系统,2002,06:687-689.
[33]张华鑫.碳基纳米器件的电磁输运性质研究[D].南京邮电大学,2013.
[34]薛武蕾.“动作疗法”在中学生舞蹈教育中的应用探究[D].中国艺术研究院,舞蹈学,2014,硕士.
[35]康立庚.饲养动物损害责任的研究[D].内蒙古大学,民商法学,2013,硕士.
[36]杨明玮.基于FGS的拥塞控制机制的研究[D].合肥工业大学,计算机软件与理论,2004,硕士.
[37]周洁雯.小儿咳喘宁口服液治疗RSV感染毛细支气管炎的临床研究[D].广州中医药大学,中医儿科学（专业学位）,2013,硕士.
[38]谢洪明,任艳艳,王倩,赵薇.民营企业并购发达国家公司的新视角——基于三花控股集团并购的案例分析[J].浙江经济,2013,19:40-41.
[39]薛禹胜,彭慧敏.电力市场与电力系统交互动态仿真设计[J].电力系统自动化,2006,23:14-20+26.
[40]杨扬.铜陵铜尾矿废弃地中参与金属硫化物氧化的微生物主要类群与分布[D].安徽大学,生态学,2014,硕士.
[41]王大海.不同基本医疗保险对居民医疗消费影响的比较研究[D].山东大学,财政学,2013,硕士.
[42]彭明亮.COS公共模型的研究与设计[D].广东工业大学,计算机科学与技术,2014,硕士.
[43]王雪青.静心制动方治疗抽动障碍疗效观察及与神经递质的相关研究[D].北京中医药大学,中医学,2013,硕士.
[44]秦川.六棱型网格式生物埂护坡上黄花根系特征及对土壤性质影响的研究[D].西南大学,水土保持与荒漠化防治,2013,硕士.
[45]帅琪峰.白菜核雄性不育两用系花蕾cDNA文库的构建及雄性不育相关基因的初步筛选[D].浙江大学,蔬菜学,2004,硕士.
[46]李因刚,柳新红,马俊伟,石从广,朱光权.浙江楠种群表型变异[J].植物生态学报,2014,12:1315-1324.
[47]叶婷婷.杭州市自驾车旅游者消费行为特征及营销策略研究[D].浙江工商大学,旅游管理（专业学位）,2014,硕士.
[48]李方菊.一种轻量级分布式的无线传感器网络多播模型研究[D].南京邮电大学,计算机通信与网间互连技术（专业学位）,2013,硕士.
[49]印德俊.不锈钢中微量锑的光度法测定[J].四川冶金.1989(04)
[50]周望存.基于数据融合的船舶内燃机故障诊断方法的研究[D].江苏科技大学,轮机工程,2014,硕士.