白癜风患者应激障碍调查及应激障碍调节药物对黑素细胞的影响

【摘要】白癜风是常见的色素脱失性皮肤病,通常认为自身免疫损伤是其最重要的发病机制,最新的研究观察到T细胞亚群有增殖分化异常及平衡失调,尤其是具有免疫抑制功能的T细胞亚群——T调节细胞(Treg)水平降低与白癜风的发病密切相关。因此糖皮质激素、他克莫司等免疫抑制剂和调节剂就成为目前临床治疗白癜风的主要药物。精神神经损伤也是白癜风的致病因素,但该领域的研究始终是个薄弱环节,针对降低精神神经损伤而进行的药物研发也处于空白状态。众所周知,各种发病诱因对机体来说就是各种不同的应激原,精神神经刺激也是一种应激原。应激是机体对内外环境中各种不同的应激原作出的非特异性防御适应反应,机体出现包括精神、神经、内分泌和免疫系统等一系列综合应答。应激负荷过强或过于持久,也可导致机体生理机能紊乱引发疾病,有学者甚至认为75%～90%的人类疾病与应激机制激活有关。本研究即从精神神经应激与白癜风发病关系入手,以白癜风患者发病前应激事件发生状况与患病后应激障碍伴发状况——应激相关的神经内分泌异常——调节精神神经应激障碍的药物对黑素细胞增殖与功能的影响为轴线,以白癜风患者体内存在的精神神经内分泌功能失调及物质异常为线索,有针对性的进行药物筛选以及药物作用机制的研究,为白癜风治疗药物的研发提供新的思路和方向。在应激反应过程中,机体的神经内分泌系统是最重要的应激反应系统,主要以下丘脑—垂体—肾上腺皮质(hypothalamus-pituitary-adrenocortical,HPA)轴相关激素如促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing-hormone,CRH)、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropichormone,ACTH)、皮质激素水平产生变化为特征,因此对HPA轴功能状况的观察是用来评价应激程度的最经典方法。应激反应时还诱导产生其它多种应激相关激素和肽类物质,如β—内啡肽(β-endophin,β-EP)、血管活性肠肽、神经肽Y(neuropeptide-Y,NPY)等,其中NPY就是交感神经系统代表性物质,在心理及躯体应激反应的核心机制中发挥重要作用,被称为“应激分子”,它对HPA轴的活动具有肯定的调节作用。此外应激损伤后机体会启动内源性损伤保护因子进行调节,其中褪黑素(melatonin,MLT)和神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)在神经营养、应激后神经损伤修复及神经功能恢复中的作用现已得到公认。NGF是最早发现的细胞生长调节因子,作为一种嗜神经多肽,NGF不仅作用于神经系统,在非神经系统中也产生重要影响,越来越多的研究发现,NGF在许多皮肤病的发病过程中发挥重要作用。NGF的来源十分广泛,不同来源的NGF具有相似的生物学活性,NGF是典型的靶源性神经营养因子,由靶组织产生和分泌,其中脑源性神经营养因子(BDNF)就是中枢神经来源的NGF家族中一个重要成员,也是目前研究最多,对其功能了解最为清楚的。调控BDNF表达的因素很多,应激是其中一个重要因素,在不同的应激条件下,BDNF水平发生不同的变化,细胞机制研究提示BDNF水平下降是与应激障碍密切相关的病理生理现象,在应激相关性抑郁症时血清BDNF水平降低。MLT是由松果体合成分泌的激素,生物学作用广泛,具有较显著的神经保护作用,研究发现MLT能通过有效促进前脑皮质细胞表达BDNF及其受体,激活细胞内保护性信号通路,减轻应激造成的细胞损伤。MLT血清浓度具有明显的昼夜节律性波动,与HPA轴激素的昼夜节律正好相反,许多研究也证实HPA轴是MLT发挥调节作用所经由的一个重要途径,实验证明HPA轴的三个水平均存在MLT受体,MLT通过MLT受体对HPA轴的三个水平进行直接调节。研究发现长期慢性的生活应激事件可引起松果体功能失调导致MLT分泌紊乱,在某些精神分裂症和抑郁症患者中均出现MLT水平降低,提示下降的MLT水平与应激障碍密切相关。这些重要的应激相关激素及神经保护因子在许多应激障碍性疾病中作为神经内分泌变化的客观指标用来反映机体的应激水平以及应激后发病机制的研究,但在白癜风患者中其表达水平如何尚未见报道。假设在白癜风患者中,血清应激相关激素及神经保护因子水平存在异常,那么理论上说通过纠正这些异常就有可能达到临床治疗白癜风的效果。黑素细胞来源于神经嵴,是皮肤、毛发以及眼睛颜色的基础,人类皮肤的颜色主要与表皮中黑素细胞合成黑素以及黑素传递至周围角质形成细胞有关。黑素在黑素细胞的黑素小体中合成,由黑素合成的主要限速酶——酪氨酸酶催化酪氨酸生成多巴和多巴醌,再经过一系列反应而合成,然后再通过黑素细胞的树突运输到附近的角质形成细胞中,形成表皮的色素。酪氨酸酶是黑素合成的关键酶,是黑素细胞分化成熟的一个特征性标志,其活性与黑素合成含量呈正相关,因而增加黑素细胞数量、激活酪氨酸酶和加速黑素合成的治疗手段对白癜风的复色有治疗效果。但是目前白癜风动物模型尚不令人满意,现行的动物实验造模方式主要是5%过氧化氢脱色法,并不完全符合白癜风的病理变化,因此关于药物治疗白癜风作用机制的研究主要集中在体外试验,观察对黑素细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素合成的影响。目前“精神神经损伤与白癜风发病的关系”该研究领域的基础仍较薄弱,可参考文献不多,因此本课题尽量采用国内外公认的经典方法进行研究,从最基础的流行病学调查开始做起。首先研究应激是否能对白癜风患者造成损伤以及白癜风患者患病后伴发的应激障碍是否明显高于正常人；再进一步对白癜风患者应激相关的神经内分泌异常进行检测,观察白癜风患者应激效应激素——血清皮质酮(CORT)水平以及神经保护因子褪黑素(MLT)、脑源性神经营养因子(BDNF)水平是否发生了变化,了解白癜风患者的应激反应状态；随后观察地塞米松(Dex)、MLT、神经生长因子(NGF)对体外培养的正常人黑素细胞增殖及功能的影响。在此基础上,结合白癜风免疫发病机制研究的最新进展,对上述三种药物体外诱导正常人前体T淋巴细胞向Treg分化进行观察,探讨它们是否通过调控Treg水平而发挥治疗作用。中药复方目前在国内白癜风治疗中具有不可替代的地位,其中滋补肝肾、理气活血类药物是治疗白癜风的最常用药物。本研究以降低精神神经应激损伤为指导思想,对具有镇静安神作用的中药复方治疗白癜风的药理机制进行了初步探索。在中药中,酸枣仁重镇养心安神,钩藤疏肝驱风安神,是常用的调节神经功能障碍的单味中药,本实验中以滋补肝肾、理气活血中药复方——益气活血合剂为基本方,分别加入酸枣仁及钩藤,组成复方1号和复方2号,观察药物体外干预对黑素细胞增殖及黑素合成功能的影响。已知患者血清中含有的许多物质和细胞因子对白癜风病情的发生发展发挥着调控作用,文献报道也证实加入患者血清后对体外培养的黑素细胞的增殖和功能都有不同程度的影响。为了解上述待筛选药物在患者血清存在时对黑素细胞的作用,本研究还将待筛选药物分别与治疗前患者血清共同干预,观察其对体外培养的正常人黑素细胞增殖与黑素合成的影响。第一部分白癜风患者应激生活事件和应激损伤状况调查目的：1.调查白癜风患者发病前及病情复发前应激生活事件及应激损伤状况；2.对白癜风患者患病后伴发的常见应激障碍–焦虑或抑郁的发生率及严重程度进行评价与分析。方法：采用病例对照方法,对55例白癜风患者和118例正常对照者进行流行病学量表调查与评定。应激生活事件调查采用杨德森生活事件量表(LifeEventScale,LES),内容包括生活事件发生与否、种类、性质、数量、影响程度及持续时间；焦虑评定采用汉密顿焦虑量表(HamiltonAnxietyScale,HAMA)14项版本,抑郁评定采用汉密顿抑郁量表(HamiltonDepressionScale,HAMD)24项版本,根据评分值来评定焦虑或抑郁的发生情况及严重程度。结果：1.应激生活事件数量：发病前或复发前1年内,除了社交方面总事件或负性事件数量,白癜风组低于正常对照组(P<0.05),家庭方面、工作学习方面事件以及总事件数量,两组差异均无显著意义(P>0.05),2.应激生活事件评分：发病前或复发前1年内工作学习方面总事件及负性事件评分、总生活事件与总负性生活事件评分均值、工作学习方面总事件与负性事件评分均值,白癜风组均高于正常对照组(P<0.05)。3.应激障碍发生情况：焦虑及抑郁评分、肯定焦虑及肯定抑郁发生率、总焦虑及总抑郁发生率比较,白癜风组均高于正常对照组,差异有显著意义(P<0.05)。结论：1.白癜风患者发病前或病情复发前接受的应激事件数量并不多于正常人,但某些类型的应激事件对患者造成的影响要显著大于正常人,提示白癜风患者可能存在应激损伤易感基因,应激损伤可能在白癜风发病及病情复发中发挥作用。2.白癜风患者焦虑或抑郁评分及发生率均高于正常人,提示白癜风患者患病后伴发应激障碍者多于正常人,表明应激障碍与白癜风发病密切相关。第二部分白癜风患者血清中重要的应激相关激素及神经保护因子测定目的：1.对白癜风患者血清中重要的应激相关激素水平及神经保护因子水平进行测定,了解白癜风患者的神经内分泌系统有无异常变化。2.了解白癜风患者患病后伴发的应激障碍与神经内分泌异常之间的相关性。方法：采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定90例病例组和87例对照组血清中应激相关激素神经肽Y(NPY)、促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮(CORT)水平以及血清神经保护因子褪黑素(MLT)和脑源性神经营养因子(BDNF)水平。采用Pearson’s相关性分析法对白癜风患者焦虑及抑郁评分与血清COR1、MLT、BDNF水平之间的关系进行分析。结果：1.血清应激相关激素及神经保护因子水平：血清CORT水平比较,白癜风组(3.169±1.006)低于正常对照组(4.095±0.976),差异有显著意义(t=6.210,P=0.000)；血清NPY水平比较,白癜风组(23.197±26.139)高于正常对照组(9.051±14.923),差异有显著意义(t=4.401,P=0.000)；血清ACTH水平比较,白癜风组(981.821±432.091)高于正常对照组(549.54±342.36),差异有显著意义(t=7.361,P=0.000)；血清MLT水平比较,白癜风组(61.513±28.193)低于正常对照组(75.497±35.576),差异有显著意义(t=2.903,P=0.004)；血清BDNF水平比较,白癜风组(340.767±133.465)低于正常对照组(389.867±132.408),差异有显著意义(t=2.306,P=0.022)。2.应激最终的效应激素——血清CORT水平与其它应激相关激素及神经保护因子之间的相关性：对90例白癜风患者的测定结果进行分析,血清CORT水平与血清BDNF水平呈正相关(r=0.447,P=0.000),与NPY(r=0.189,P=0.074)、ACTH(r=0.089,P=0.404)、MLT(r=-0.064,P=0.546)水平无显著相关。3.神经内分泌异常与应激障碍之间的相关性：55例白癜风患者血清CORT水平与焦虑评分(r=-0.752,P=0.000)及抑郁评分(r=-0.626,P=0.000)呈负相关；血清BDNF水平与焦虑评分(r=-0.815,P=0.000)及抑郁评分(r=-0.571,P=0.000)也呈负相关；但患者血清MLT水平与焦虑评分(r=0.082,P=0.550)及抑郁评分(r=0.009,P=0.946)无显著相关。结论：1.白癜风患者存在应激效应激素——血清CORT水平降低,其上游的应激相关激素NPY、ACTH水平升高,提示患者的神经内分泌通路存在异常,并可能在该病发病过程中起重要作用,该结果也为糖皮质激素等内分泌激素治疗白癜风提供了实验依据。2.白癜风患者中血清MLT、BDNF水平降低,纠正血清MLT、BDNF异常有可能成为临床治疗白癜风的一个新途径。3.白癜风患者的应激障碍与其血清CORT和BDNF水平呈显著负相关。第三部分调节应激障碍药物对黑素细胞增殖与功能的影响目的：1.了解待筛选药物对体外培养的正常人MC增殖、Tyr活性及黑素含量的影响；2.观察Dex、MLT、NGF体外诱导Treg分化作用,对药物作用机制进行初步探讨。方法：分别用cck-8法、多巴氧化法和NaOH法进行MC增殖、Tyr活性和黑素含量的检测,磁珠分选正常人外周血中CD4+CD25-的前体T淋巴细胞,流式细胞仪检测Treg比值。结果：1.Dex、MLT、NGF对体外培养的MC的影响及体外诱导Treg分化的作用1.1Dex、MLT、NGF单独干预对MC的作用与空白对照相比,地塞米松、NGF对MC增殖、Tyr活性和黑素含量均有显著促进作用(P<0.05)；而MLT对其无明显影响(P>0.05)。1.2Dex、MLT、NGF分别与治疗前患者15%血清共同干预对MC的作用先对血清浓度进行筛选,发现2%、5%及10%血清促进MC细胞增殖,而15%及20%血清抑制MC增殖,故选取15%血清进行后面的实验。与健康人(51.912±6.080)相比,加入患者血清后,MC增殖率显著增高(P<0.01)；与治疗前(76.904±9.519)相比,治疗后患者血清(98.065±14.079)对MC增殖有显著促进作用(t=3.980,P=0.011)。与治疗前患者血清共同干预,NGF对MC增殖、Tyr活性和黑素含量均有显著促进作用(P<0.05)；地塞米松对MC增殖和黑素含量有显著促进作用(P<0.05),对Tyr活性无明显影响(P>0.05)；而MLT对MC增殖Tyr活性和黑素含量均无明显影响(P>0.05)。1.3Dex、MLT、NGF体外诱导Treg分化与空白对照(5.390±0.082)相比,NGF组(6.170±0.104)促进前体T淋巴细胞向Treg分化(t=17.298,P=0.003),Dex组(4.140±0.573)抑制前体T淋巴细胞向Treg分化(t=4.348,P=0.049),MLT组(5.880±0.219)对体外诱导Treg分化无显著影响(t=3.500,P=0.073)。2.中药对体外培养的Mc的影响2.1中药单独干预对MC的作用与空白对照相比,益气活血合剂对MC增殖和黑素含量有显著促进作用(P<0.05),对Tyr活性无明显影响；复方1号及复方2号对Tyr活性和黑素含量有显著促进作用(P<0.05),对MC增殖无明显影响；但复方1号(169.679±31.862)及复方2号(139.458±20.926)分别与益气活血合剂(148.193±19.738)相比,对黑素含量的影响并无显著差异(P>0.05)。进一步对组方中各单味药的作用分别进行检测。①对MC增殖的影响：黄芪、鸡血藤使MC增殖率增高,钩藤使MC增殖率降低(P<0.05)；②对Tyr活性的影响：丹参、酸枣仁能增强Tyr活性(P<0.05)；③对MC黑素合成的影响：黄芪、丹参、酸枣仁使黑素含量增高(P<0.05),而鸡血藤、钩藤对黑素含量无显著影响(P>0.05)。2.2中药分别与治疗前患者15%血清共同干预对Mc的作用共同干预时,益气活血合剂使MC增殖率增高,但对Tyr活性和黑素含量无明显作用,而复方1号及复方2号对MC增殖、Tyr活性和黑素含量均有显著促进作用(P<0.05)；与益气活血合剂相比,复方2号能显著增加黑素含量(t=3.811,P=0.012)。结论：1.NGF对MC增殖、Tyr活性与黑素合成均有显著促进作用,且对体外诱导Treg分化有促进作用,提示有较好的临床应用前景。2.药物既可以通过促进MC增殖途径(如Dex、黄芪、益气活血合剂),也可以通过增强Tyr活性(如丹参、酸枣仁、复方1号、复方2号)而增加黑素含量。3.复方1号、复方2号与血清共同干预时对MC增殖、Tyr活性及黑素含量均有显著促进作用,提示这两种复方在体内促黑素合成功效可能更好。4.理气活血方剂加入镇静安神类药物钩藤可以增强促黑素合成功效。5.与健康人15%血清相比,患者血清对MC增殖有显著促进作用,表明患者血清中既有致病因子,也有各种促进恢复或维稳的调控因子,各种因子相互影响,组成一个复杂精妙的调控网络,其共同作用的综合效果决定着疾病的发生和转归。
【作者】隗祎；
【导师】李明；
【作者基本信息】复旦大学，皮肤病与性病学，2012，博士
【关键词】白癜风；应激；焦虑；抑郁；皮质酮；褪黑素；神经生长因子；酸枣仁；钩藤；黑素细胞；

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