氙气预适应对急性肾损伤的保护作用及其机制研究

【摘要】第一部分：氙气预适应对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及其机制背景和目的：急性肾损伤(acutekidneyinjury,AKI)是临床常见的重、危、急症,其发病率呈逐年上升的趋势。缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤是导致AKI的重要因素。因此,寻找有效、特异性的干预措施来预防和治疗急性肾损伤是临床亟待解决的重要问题。药理性预适应(pharmacologicalpreconditioning)是在缺血预适应(ischemicpreconditioning,IP)基础上发展起来的,通过药物的直接或间接药理作用,激活机体内源性保护机制,产生内源性保护物质,从而起到保护组织、细胞的作用。现已证明许多药物如腺苷、挥发性麻醉剂等均能诱导产生预适应样器官保护作用。氙气作为一种挥发性麻醉剂不仅具有理想的吸入麻醉剂的许多重要属性,而且还具有独立于麻醉作用之外的器官保护作用,如心脏、脑、肾脏等重要器官。本研究以小鼠肾脏缺血再灌注损伤为模型,观察氙气预处理对肾脏的保护作用,进而探讨氙气预适应的作用机制,并采用锁核苷酸(lockednucleicacid,LNA)修饰技术敲弱(knockdown)微小RNA-21(microRNA-21,miR-21),研究miR-21与其下游靶基因及其信号通路在氙气预适应中的作用。材料和方法：采用雄性C57BL/6J小鼠,随机分组。假手术组(sham):只分离两侧肾蒂,不进行夹闭；缺血再灌注组(I/R)：用无损伤动脉夹夹闭两侧肾蒂30min,再恢复灌注24h后处死小鼠,留取血和肾脏标本；氮气预适应组(N2+IR)：预先暴露于70%氮气+30%氧气2h,24h后再予肾脏缺血再灌注损伤(同I/R)；氙气预适应组(Xe+IR):预先暴露于70%氙气+30%氧气2h,24h后再予肾脏缺血再灌注损伤(同I/R)；单纯氙气干预组(Xe)：仅予70%氙气+30%氧气暴露2h,继之分别于2h、12h、24h和48h后处死小鼠并留取标本；单纯氮气干预组(N2)：仅予70%氮气+30%氧气暴露2h,处理同前；锁核苷酸修饰的anti-miR-21或anti-scramble干预组小鼠(Xe+anti-miR-21+IRorXe+anti-scramble+IR):在氙气(70%氙气+30%氧气)暴露前30min内给于LNA-anti-miR-21或LNA-anti-scramble相应处理,继之予氙气预处理及缺血再灌注损伤(同氙气预适应组),观察时间分别为恢复灌注后12h、24h和48h。每组每个观察点n=6。采用酶法测定血清肌酐(Scr)浓度、尿素酶-GLDH法测定尿素氮(BUN)浓度来评价肾功能；HE染色观察肾组织的病理改变；TUNEL检测细胞凋亡情况；免疫组织化学法检测肾组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和ED-1表达；TBARS法检测肾组织中丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量,来评价氧化应激损伤；通过real-timeRT-PCR检测miR-21和相关基因mRNA表达;Westernblot检测PDCD4、PTEN、AKT、p-AKT、HIF-1α及其靶蛋白VEGF的表达。结果：1)与sham组相比较,I/R组与N2+IR组小鼠肾脏再灌注24h后Scr、BUN浓度明显升高(Scr,0.15±0.02mg/dl对比1.60±0.44mg/dl和1.05±0.30mg/dl;BUN,25.05±3.71mg/dl对比173.05±8.68mg/d1和127.14±23.46mg/d1,p<0.05)；而Xe+IR组Scr、BUN浓度较I/R组与N2+IR组明显减低(Scr,0.28±0.06mg/dl;BUN,45.86±12.97mg/dl,p<0.05)。2)组织形态学上,I/R组与N2+IR组在再灌注后24h肾脏皮髓交界处和外髓肾小管间质损伤严重,表现为广泛的小管上皮细胞坏死,而Xe+IR组损伤较轻,表现为散在的小管上皮细胞变性、坏死和管型形成等,小管间质损伤评分较I/R组与N2+IR组明显减低(p<0.05)。3)I/R组与N2+IR组在再灌注后24h出现明显的细胞凋亡,主要位于皮髓交界处,而Xe+IR组小鼠肾脏TUNEL阳性细胞数较I/R组与N2+IR组明显减少(4.80±1.23/HPF对比11.10±2.33/HPF和10.10±1.23/HPF,P<0.05)。4)I/R组与N2+IR组小鼠在在肾脏再灌注24h后,肾组织中MDA的含量明显高于Xe+IR组(1.43±0.42μmol/L与1.35±0.25μmol/L对比1.00±0.09μmol/L,P<0.05),提示I/R组与N2+IR组肾脏氧化应激损伤明显。5)免疫组化显示：与sham组比较,I/R组、N2+IR组和Xe+IR组小鼠再灌注24h后肾组织中均出现TNF-α、ED-1的较高表达,且三组之间无明显差异。6)real-timePCR检测显示,与氮气预处理相比较,氙气预处理后2小时肾组织中miR-21表达明显升高(p<0.05),24h达峰值,48h后回落至基线水平；与I/R组与N2+IR组相比较,Xe+IR组小鼠再灌注24h后肾组织miR-21表达明显升高(p<0.05)。7)LNAanti-miR21明显降低氙气预处理后以及氙气预处理联合I/R后(Xe+anti-miR-21组和Xe+anti-miR-21+IR组)肾组织中的miR-21表达水平；抑制miR-21的表达,明显减弱了氙气预适应的肾脏保护作用,表现为Xe+anti-miR-21+IR组较Xe+scramble+IR组小鼠再灌注后24h、48h血肌酐明显升高(24h:1.37±0.28mg/dl与0.81±0.14mg/dl,48h:0.78±0.10mg/dl与0.47±0.08mg/dl,p<0.05),肾组织病理损伤明显加重。8)抑制miR-21的表达,对靶基因PDCD4和PTEN在mRNA水平上的表达无明显影响,但可以明显上调PDCD4和PTEN蛋白的表达(p<0.05)；对t-AKT蛋白表达无显著影响,但可以明显抑制p-AKT的表达(p<0.05)；与Xe+scramble+IR组比较,Xe+anti-miR-21+IR组小鼠再灌注后24h肾小管上皮细胞凋亡(TUNEL阳性细胞)明显增多(p<0.05)。9)与氮气预处理组相比较,氙气预处理可以呈时间依耐性上调HIF-1α及其靶蛋白VEGF的表达水平,24h时达峰值(p<0.05),48h后逐渐下降；与Xe+scramble+IR组比较,Xe+anti-miR-21+IR组小鼠再灌注后24h时,肾组织HIF-1α蛋白表达水平明显下降(p<0.05)。结论：1)氙气预适应可以明显减轻小鼠肾脏缺血再灌注损伤,表现为肾功能改善,肾组织病理损伤减轻,减少肾小管细胞凋亡,减轻氧化应激反应,但对炎症反应无明显影响；2)氙气预适应可以呈时间依耐性上调肾组织miR-21的表达,上调HIF-1α及其靶蛋白VEGF的表达,且二者的变化趋势相近；3)通过LNAanti-miR-21抑制氙气预适应诱导的miR-21表达,可以加重肾脏缺血再灌注损伤,肾功能恶化,病理损伤加重,从而削弱了氙气预适应的肾保护作用;4)抑制miR-21的表达,对靶基因PDCD4和PTEN在mRNA水平上的表达无明显影响,但可以增加PDCD4和PTEN蛋白的表达；对t-Akt蛋白表达无显著影响,但可以明显抑制p-Akt蛋白的表达；增加肾小管上皮细胞凋亡；同时也抑制了HIF-1α及其靶蛋白VEGF的表达。总之,氙气预适应一方面通过上调miR-21,抑制其下游促凋亡基因PDCD4和PTEN,并激活PTEN/Akt信号通路,抑制细胞凋亡,从而实现肾脏保护作用；另一方面,可能通过激活HIF-1α及其下游靶基因而起到肾保护作用。而miR-21与HIF-1α之间是否存在反馈联系有待进一步证实。第二部分：氙气对庆大霉素诱导急性肾损伤的保护作用及其机制背景和目的：药物性肾损伤是引起急性肾损伤(AKI)的常见原因之一,临床上大约10-20%患者在应用常规剂量的氨基糖甙类抗生素时出现肾损伤,尤其是庆大霉素。庆大霉素肾损伤的机制是多方面的,包括肾小管上皮细胞的凋亡及坏死、炎症反应、氧化应激、肾脏血流动力学改变以及肾小球滤过率下降等等。尽管其肾毒性,但由于庆大霉素具有广谱的抗菌活性、价廉等特点,仍然被广泛应用于临床,因而寻求有效的预防和治疗庆大霉素肾损伤的措施,是广大临床工作者十分关注的问题。研究发现氙气可以提高肾小管上皮细胞的存活力,抑制细胞凋亡,而氙气预适应可以通过上调HIF-1α及其下游靶基因的表达,对肾脏缺血再灌注损伤具有明显的保护作用。本研究以庆大霉素诱导大鼠急性肾损伤为模型,采用氙气间断干预,观察大鼠血、尿的生化指标、组织病理、细胞凋亡、氧化应激及炎症反应等情况,判断氙气对肾脏的保护作用,并以缺氧诱导因子及其下游靶基因为靶点,探讨其可能的机制。材料和方法：采用雄性Wistar大鼠,随机分组,对照组(control):腹腔注射生理盐水lml,连续7天；庆大霉素组：腹腔注射硫酸庆大霉素(100mg/kg.d)连续7天；氮气处理组(N2+gent):首先予70%氮气+30%氧气暴露2h,24h后予庆大霉素腹腔注射(100mg/kg.d)连续7天,此间分别于第2、4、6天给药前再次给予70%氮气+30%氧气暴露30min；氙气处理组(Xe+gent):首先予70%氙气+30%氧气暴露2h,24h后予庆大霉素腹腔注射(100mg/kg.d)连续7天,此间分别于第2、4、6天给药前再次给予70%氙气+30%氧气暴露30min；上述各组设分别于给药结束后2天、4天和7天,处死大鼠,留取血液、24小时尿液和肾脏标本进行生化、病理和分子生物学分析。单纯氮气处理组(N2)：仅予70%氮气+30%氧气暴露2h；单纯氙气处理组(Xe)：仅予70%氙气+30%氧气暴露2h；24小时后处死大鼠,留取肾脏标本。各组每个观察点n=6。HE染色观察肾组织的病理改变；TUNEL检测细胞凋亡情况；免疫组织化学法检测肾组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和ED-1表达；TBARS法检测肾组织中丙二醛(MDA)的含量,来评价氧化应激损伤；通过real-timePCR检测miR-21和相关基因mRNA表达;Westernblot检测HIF-1α/2α及其靶蛋白VEGF的表达,以及PHD1、PHD2、PHD3蛋白的表达。结果：1)与对照组相比,庆大霉素组、氮气处理组和氙气处理组在给药结束后48小时,肾功能均明显减退,表现为Scr与BUN明显升高,而内生肌酐清除率明显下降(Scr:0.21±0.04mg/dl对比1.42±0.21mg/dl,1.24±.52mg/dl,1.00±0.28mg/dl:BUN:6.01±0.96mmol/L对比29.72±6.85mmol/L,22.40±5.90mmol/L,21.59±5.11mmol/L；Ccr:6.15±1.18ml/min/kg.bw对比1.61±0.38ml/min/kg.bw,2.03±0.69ml/min/kg.bw,2.28±0.36ml/min/kg.bw,P<0.05)；氙气处理组与庆大霉素组、氮气处理组相比较,Scr和BUN有所下降,但尚未达到显著性差异(P>0.05)；反映肾小管损伤的指标尿NAG酶在三个实验组中也明显升高(11.26±1.40U/L对比79.56±4.57U/L,73.93±4.58U/L,65.57±7.14U/L,p<0.05),氙气处理组与庆大霉素组、氮气处理组相比较,尿NAG酶明显下降,有统计学意义(p<0.05)。在给药结束后第4天,氙气处理组与庆大霉素组、氮气处理组相比较,肾功能明显改善,表现为Scr与BUN明显降低,内生肌酐清除率明显升高,尿NAG酶也明显减低(Scr:0.59±0.17mg/dl对比0.95±0.32mg/dl,1.18±0.66mg/dl:BUN:12.47±5.40mmol/L对比18.80±5.62mmol/L,19.25±6.35mmol/L:Ccr:4.06±0.62ml/min/kg.bw对比2.47±0.38ml/min/kg.bw,2.37±0.40ml/min/kg.bw:NAG:26.53±4.07U/L对比49.61±5.17U/L,51.16±4.17U/L,p<0.05)。至给药后第7天,三个实验组肾功能均恢复良好,Scr.BUN与Ccr在三组见均无明显差异,但与庆大霉素组、氮气处理组相比较,氙气处理组的尿NAG酶下降更为明显(p<0.05)。2)组织形态学上,庆大霉素组与氮气处理组在给药结束后48小时,近曲小管上皮细胞出现广泛的坏死、脱落,基底膜断裂,间质水肿和少量炎细胞浸润；而氙气处理组近曲小管上皮细胞呈灶状变性,偶见坏死及少量炎细胞浸润,小管间质损伤评分较庆大霉素组与氮气处理组明显减低(2.67±0.33对比3.50±0.22,3.33±0.82,p<0.05)。第4天时,三组大鼠肾脏病理损伤均有所改善,但氙气处理组较庆大霉素组与氮气处理组病理损伤更为减轻(p<0.05),至第7天,三组均恢复良好,之间无显著性差异。3)给药结束后48小时,庆大霉素组与氮气处理组大鼠肾脏出现较多凋亡的肾小管上皮细胞,而氙气处理组肾脏TUNEL阳性细胞数则明显减少(16.50±0.76/HPF对比20.40±2.88/HPF,19.60±2.91/HPF,P<0.05)；至第4天,氙气处理组肾脏TUNEL阳性细胞数仍明显低于庆大霉素组与氮气处理组(p<0.05)。4)给药结束后第4天,庆大霉素组与氮气处理组肾组织中MDA的含量明显高于氙气处理组(1.87±0.02μmol/L对比2.13±0.10μmol/L,2.06±0.05μmol/L:P<0.05),提示氙气处理可以减轻肾脏氧化应激损伤。5)与对照组比较,庆大霉素组、氮气处理组和氙气处理组大鼠在给药结束后第2、4天时,肾组织中均出现TNF-α、ED-1蛋白的高表达,且三组之间无明显差异(P>0.05)；血清TNF-1α浓度在庆大霉素组、氮气处理组和氙气处理组三组之间也无显著性差异(第2天：31.82±2.87pg/ml,31.46±4.42pg/ml,28.25±4.06pg/ml；第4天：15.23±1.44pg/ml,15.37±2.79pg/ml,17.35±3.15pg/ml,P>0.05)。6)real-timePCR检测显示,与单纯氮气预处理相比较,氙气预处理后24小时肾组织中HIF-2a及其靶基因VEGF表达明显上调(p<0.05),而HIF-1αmRNA表达水平无变化；PHD2mRNA表达上调而PHD1mRNA下调,PHD3mRNA表达无变化；miR-21表达明显上调(p<0.05)。另外,miR-21表达明显上调(p<0.05)。7)Westernblot检测显示：与单纯氮气预处理相比较,氙气预处理后24小时肾组织中HIF-2a及其靶蛋白VEGF表达明显上调(p<0.05),而HIF-1α蛋白表达水平无变化；PHD2蛋白表达明显上调(p<0.05)而PHD1下调,PHD3蛋白表达水平无变化；在给药结束后第2天,与对照组比较,庆大霉素组、氮气处理组及氙气处理组肾脏HIF-2α及其靶蛋白VEGF表达均明显上调(p<0.05),但三组之间无明显差异；而HIF-1α蛋白表达水平无变化。在给药结束后第4天,与庆大霉素组、氮气处理组相比较,氙气处理组肾脏HIF-2α及其靶蛋白VEGF表达明显上调(p<0.05)。结论：1)氙气干预可以明显减轻大鼠庆大霉素诱导的急性肾损伤,表现为肾功能改善,肾组织病理损伤减轻,减少肾小管细胞凋亡,减轻氧化应激反应,但对炎症反应无明显影响。2)氙气预处理在基因及蛋白水平上上调肾组织中HIF-2α及其靶基因VEGF的表达,氙气干预也能进一步上调庆大霉素处理大鼠肾脏中的HIF-2α及其靶基因VEGF的表达水平,但对HIF-1α无影响；考虑HIF2-α及其靶基因可能参与氙气的肾保护作用。3)氙气预处理在基因及蛋白水平上上调肾组织中PHD2的表达,下调PHD1,但对PHD3无影响；考虑氙气诱导的PHD2上调可能参与了对肾脏HIF表达的调控,PHDs与HIF之间的调控关系有待进一步明确。4)氙气预处理可以上调肾组织中抗凋亡基因miR-21的表达,因而氙气可能通过miR-21的抗细胞凋亡而起到肾保护作用。
【作者】贾平；
【导师】丁小强；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2013，博士
【关键词】氙气；预适应；缺血再灌注；miR-21；缺氧诱导因子；庆大霉素；急性肾损伤；脯氨酸羟化酶；

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