Sigma-1受体的激动剂对电压门控型钠离子通道Na_v1.2的调节作用研究

【摘要】电压门控型钠离子通道(VGSC)主要表达于中枢神经系统(CNS)中,参与动作电位产生过程,并且是众多局麻药、镇痛及抗惊厥药物和毒素的作用靶标。Sigma-1受体也主要分布于CNS,主要参与调节细胞膜上的离子通道、神经元的电活动以及递质释放等过程。Sigma-1受体的多种配体,主要用于抗精神疾病、抗心律失常及镇咳等方面的治疗。其中,(+)-SKF10047,是一种sigma-1受体的选择性激动剂,一直被作为研究sigma-1受体的常用工具药物。已有研究表明(+)-SKF10047可以通过sigma-1受体的激活对Na+、K+、Ca2+等离子通道进行调节。本研究中,使用大量表达内源sigma-1受体的HEK293T细胞和几乎不表达内源sigma-1受体的COS-7细胞系作为模型,通过在HEK293T和COS-7细胞系中瞬时表达大鼠的Nav1.2、Nav1.4和Nav1.5离子通道,并使用sigma-1受体的选择性激动剂(+)-SKF10047、PRE-084和DM(Dextromethorphan),以及拮抗剂BD1047和NE-100作为主要的工具药物,主要研究了sigma-1受体的激动剂对Nav1.2通道的调节作用机制。使用膜片钳全细胞记录的方法,记录通道在给药前后的电流INa的变化。在HEK293T细胞中表达Nav1.2,100μM的(+)-SKF10047对INa。产生瞬时抑制作用,且在1～2min内达到稳定,抑制率约为40%,并且该药物对INa。的抑制作用具有浓度依赖性、频率依赖性和使用依赖性。该药物对Nav1.2的稳态激活特性没有影响,但能够显著地促使Nav1.2的稳态失活曲线向超极化方向偏移约27mV。同时,使用sigma-1受体的特异性拮抗剂BD1047或NE-100不能抑制(+)一SKF10047对INa。的抑制作用；使用sigma-1受体的shRNA质粒干扰HEK293T细胞内源sigma-1受体的表达,或者在COS-7细胞中过表达Navl.2通道,或者在COS-7细胞中共同过表达sigma-1受体和Nav1.2通道,再给药(+)-SKF10047,其对INa。的抑制作用均不发生明显改变。在电极内液中给药PKA信号通路阻断剂H-89和PKAI.PKC信号通路阻断剂BIMI和Go6976、G蛋白的拮抗剂NF023和NF449以及G蛋白的激动剂GTPγS,均不能影响(+)-SKF10047对Nav1.2的抑制作用。此外,胞外孵育毒素PTX和CTX来不可逆地改变G蛋白信号,同样不改变(+)-SKF10047对Nav1.2的抑制作用。通过基因定点突变,突变Nav1.2通道上的局麻药结合位点氨基酸W1716.F1764.Y1771后,发现F1764A点突变对(+)-SKF10047的作用有显著抑制,W1716C不影响药物对INa。的抑制作用,Y1771A则使INa。的抑制率稍有升高。通过在不同的刺激频率下给药记录,发现(+)-SKF10047对Nav1.2电流的抑制作用能随刺激频率的升高而增强,并能够使Nav1.2通道电流从失活中恢复的速度显著减慢,同时药物的作用具有使用依赖性,说明药物更容易与去极化状态下的通道发生结合。另外,在HEK293T中瞬时表达Nav1.4或Nav1.5通道,并给药100μM的(+)-SKF10047,发现药物对钠电流的抑制率均在40%以上。而在COS-7细胞中瞬时表达Nav1.4或Navl.5通道,给药后INa抑制率与HEK293T细胞上的结果没有显著性差异。在颗粒神经元和皮层神经元上,给药100μM的(+)-SKF10047后,细胞总体的内向钠电流同样受到抑制,抑制率分别为31.1±2.6%和38.0±1.8%。此外,与(+)-SKF10047同属一类的另一个sigma-1受体的选择性激动剂DM,对HEK293T和COS-7中外源表达的Nav1.2电流的抑制作用分别约为65%和68%。且该药物对INa。的抑制作用亦不能被BD1047或NE-100所阻断,而Nav1.2的F1764A点突变则可以显著降低该药物对INa。的抑制作用。另一种类的sigma-15受体选择性激动剂PRE-084对HKE293T中瞬时表达的Nav1.2的INa抑制作用则较低,约为14%。根据以上的研究结果,我们首次提出sigma-1受体的选择性激动剂(+)-SKF10047对Nav1.2离子通道的抑制作用不依赖于sigma-1受体的激活或G蛋白或者PKA、PKC信号通路,而是通过药物直接与通道的孔区结构的关键位点结合,改变通道的构象,从而抑制INa。并且,推测苯基吗啡类的sigma-1受体的激动剂可能以同样的直接作用的方式抑制Nav1.2。同时,(+)-SKF10047对Nav1.4、Navl.5及神经元钠通道的抑制作用,也表明该sigma-1受体的激动剂对VGSC可能具有普遍性的抑制作用。而sigma-1受体的配体对于其它类型的VGSC的抑制作用机制尚有待进一步探究。这不仅能够进一步了解sigma-1受体配体的药理学作用机制,避免临床用药的交叉作用,而且也能为新药的开发提供新的理论参考。
【作者】高晓飞；
【导师】梅岩艾；胡长龙；
【作者基本信息】复旦大学，生物物理学，2012，博士
【关键词】电压门控型钠离子通道；Na_v1.2；sigma-1受体；(+)-SKF10047；INa；抑制作用；全细胞膜片钳记录；

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