柑橘皮渣降解菌的筛选及其相关特性研究

【摘要】我国是世界上主要的柑橘生产国之一,在江西,四川,湖南,湖北,重庆,四川等地区广泛栽培。在2011年,柑橘种植面积和产量均达到世界第一,分别达到2.21×106hm2和2.91×107t。目前,我国每年约加工柑橘1.01×106t,约产生柑橘皮渣5.06×105t,随着柑橘加工业的发展,柑橘皮渣的量逐渐增加。加工后产生的大量柑橘皮渣,未经处理极易发生腐败,污染水体和土壤,危害环境,严重影响人们的生活健康。因此柑橘皮渣问题逐步引起人们的关注,亟待无害化处理。目前,对柑橘皮渣的处理方式主要有卫生填埋、烘干作动物饲料、提取有效活性物质。卫生填埋处理需要占用大量耕地,且产生大量渗透液和臭气,严重污染环境。柑橘皮渣含水量高(>80%)和大量果胶(20%),加之果胶与水形成吸附水,烘干作动物饲料耗能大,成本高,难以推广。提取柑橘皮渣中有效活性物质,如香精油、色素、果胶和类黄酮物质,增加了皮渣的附加产值,但是并没有有效减少皮渣,反而在一定程度上增加了废弃物的体积和种类,造成了更严重的危害。因此,目前柑橘皮渣的处理方式并未有效处理皮渣,柑橘皮渣已成为限制柑橘产业发展的重要因素之一柑橘皮渣中含有约20%果胶和15%纤维素,大量水与果胶结合以吸附水的形式存在,增加了皮渣自然脱水难度；皮渣中高分子的纤维素和果胶的物质,增加了微生物对皮渣的降解难度；此外,柑橘皮渣中还含有约0.3%-0.8%的香精油,对绝大部分革兰氏细菌的生长有抑制作用,同时加工后的含有的有机酸,皮渣pH降低,导致普通微生物难于降解。因此,本研究以柑橘果园土壤和农田堆肥为菌源,采用柑橘香精油耐受性、刚果红染色等多种分离筛选方法,筛选出了高效优良降解柑橘皮渣的菌株L207和L702；并对其最佳产酶条件以及对柑橘皮渣的降解能力进行相关研究,最后对其生物学地位进行了鉴定,试验结果如下：1、柑橘皮渣降解菌的分离筛选：将采集到的土样接入不同培养基中,分离获得细菌五株,编号为L106、L202、L207、L309、L702。根据菌株对柑橘香精油耐受性、纤维素酶和果胶酶活性高低结果,筛选出优良的皮渣降解菌L207和L702。结果表明：(1)采用滤纸片扩散法测定香精油对菌株的抑菌圈直径大小,发现在相同浓度的香精油条件下,菌株L207和L702的抑菌圈直径小于其他供试菌株,说明其对柑橘香精油具有较好的耐受作用；采用连续稀释培养法,将菌株L207和L702在不同浓度精油培养基中培养,发现L207和L702均在精油浓度为25.0%的培养基能够生长,超过该浓度不能存活,说明对柑橘香精油的最大耐受浓度达到25.0%,是两株对柑橘香精油有较高耐受能力的菌株。(2)分别以羧甲基纤维素钠和果胶为唯一碳源,采用刚果红染色,发现菌株L207和L702的水解圈直径明显大于CK菌株；对CK菌株、菌株L207和L702进行摇瓶产酶培养,测得其纤维素酶活性大小关系为：L702>L207>CK,分别为CK的2.08倍和1.01倍,差异性显著(p=0.05)；其果胶酶活性大小关系为：L207>L702>CK,分别为CK的12.68倍和7.30倍,差异性显著(P=0.05)。表明菌株L207和L702是两株纤维素和果胶酶活性较强的菌株。2、对菌株L207和L702产酶条件进行优化,结果表明：菌株L207的纤维素酶和果胶酶的最佳产酶条件具有基本一致性,即均在培养温度为40℃、pH6.0、培养时间为48h至60h、接种量为4%(V/V)的条件下达到最大值；菌株L702的纤维素酶活性在培养温度为40℃、pH6.0、培养时间在48h至60h、接种量为4%(V/V)条件下达到最大值；果胶酶活性在培养温度为40。C、pH6.0、培养时间为36h和72h、接种量为6%(V/V)达到最大值。3、菌株L207和L702生物学鉴定：通过形态学观察、生理生化特征和16SrDNA系统发育分析,得知菌株L207和L702菌落均呈乳白色且不透明,有稍微隆起,表面湿润,有少许特殊气味；均属于革兰氏阳性菌,芽孢为椭圆形,且居中不膨大。基于基因片段序列的同源性比较分析发现,发现菌株L207和L702与Bacilluslicheniformis中E9和DQgbc4相似。综上,可鉴定菌株L207和L702为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。4、菌株L207和L702对柑橘皮渣的实际降解效果测定结果显示：堆置50d后,皮渣堆肥中纤维素降解率达到84.45%,果胶降解率达到65.93%；含水量为16.57%(≤20%),总养分含量为4.71%(>4.0%),均达到国家有机肥标准(NY525-2002)。这说明菌株L207和L702是两株降解柑橘皮渣能力较强的微生物菌株。
【作者】李世忠；
【导师】李勇；
【作者基本信息】西南大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】柑橘皮渣降解菌；柑橘香精油；纤维素酶；果胶酶；鉴定；

【参考文献】
[1]康兴斌,康玉文.基于FPGA的DVI程序设计与开发[J].漳州职业技术学院学报,2014,02:21-25.
[2]刘泊雷.西藏中波水电站库岸边坡稳定性预测研究[D].成都理工大学,地质工程,2013,硕士.
[3]余梅生,易禹,刘文远.OLAP中MDX原理的研究与实现[A].中国计算机学会数据库专业委员会.第十八届全国数据库学术会议论文集（技术报告篇）[C].中国计算机学会数据库专业委员会:,2001:5.
[4]李亚鹏.棉铃虫田间种群对三种杀虫剂的抗性监测及对氰戊菊酯抗性机理的研究[D].南京农业大学,昆虫学,2012,硕士.
[5]王柏林.水轮发电机组的模型参考自适应控制[J].自动化学报,1987,06:408-415.
[6]田清龙.空域图像LSB匹配隐写分析技术[D].湖南大学,计算机技术,2012,硕士.
[7]王殿武.中国省际工业绿色全要素生产率的测度及空间效应[D].吉林大学,数量经济学,2014,硕士.
[8]高伟怡.二肽基肽酶4抑制剂对2型糖尿病患者胰岛素抵抗的作用的系统评价[D].山东大学,临床医学（专业学位）,2013,硕士.
[9]陈宇慧,杨晓翔,朱志斌,钟舜聪.热障涂层界面形貌参数对残余应力的影响[J].应用力学学报.
[10]刘元章.企业绩效管理研究[D].首都经济贸易大学,劳动经济学,2004,硕士.
[11]岳风娟.复合纳米颗粒及自旋阀中自旋输运的研究[D].南京大学,凝聚态物理,2012,博士.
[12]张金石.双色荧光示踪胶质瘤原位移植模型的建立及其恶变的肿瘤间质细胞耐辐射特性的研究[D].苏州大学,神经外科学,2014,硕士.
[13]蔡欢欢.集体土地征收立法与农民权益保护[D].兰州大学,民商法学（专业学位）,2013,硕士.
[14]姚骏,陈知前,李清,余梦婷,周特,赵磊.不平衡且谐波畸变电网电压下双馈风电系统控制策略[J].电力系统自动化,2014,18:6-12.
[15]郭静.青少年癫痫患儿生活质量的研究[D].山东大学,儿科学（专业学位）,2013,硕士.
[16]蒋晨.风电场对电网的最优潮流影响分析及无功优化研究[D].兰州理工大学,电力电子与电力传动,2014,硕士.
[17]车帅.唐宋时期湖石题材绘画的技法语言分析[D].中央美术学院,美术学,2013,硕士.
[18]周李智,王万良,徐新黎,赵燕伟.小水电生态径流计算数据预处理方法[J].小水电,2013,05:29-32+20.
[19]王菊红.我国调查性报道侵权问题研究[D].西南政法大学,新闻学,2012,硕士.
[20]陈冉.戈夫曼互动理论视角下的医患会话研究[D].西南大学,英语语言文学,2014,硕士.
[21]赵荣祥,张菊,刘娟,张新政.浙江省高校院所加强国际科技合作的探索[J].杭州科技,2014,02:41-43.
[22]张志跃,巩秀花,蔡文博.舰船大功率柴油机数值数据库检索系统研究[J].舰船科学技术.1993(05)
[23]赵舒颖.中日股东代表诉讼当事人问题比较研究[D].湖南师范大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[24]孙金焰.工笔人物画中的色彩语言与线条形式研究[D].吉林大学,美术学,2014,硕士.
[25]丁涛,崔翰韬,顾伟,万秋兰.基于区间和仿射运算的不确定潮流算法[J].电力系统自动化,2012,13:51-55+115.
[26]姜子廷.负压效应对人胰腺癌细胞株SW1990转移抑制作用的实验研究[D].扬州大学,内科学,2011,硕士.
[27]许向文.基层公务员绩效考核有效性研究[D].华侨大学,公共管理（专业学位）,2014,硕士.
[28]庞纪彩.尼罗罗非鱼MHCII类基因的克隆与表达特征及多态性研究[D].上海海洋大学,水产养殖,2013,硕士.
[29]李帅.美国历史上“排华”与“排日”运动比较研究[D].华中师范大学,世界史,2013,硕士.
[30]刘炳伟.锅炉钢材腐蚀破坏及机理研究[D].郑州大学,材料工程（专业学位）,2013,硕士.
[31]刘宏昌.地源热泵能效监测系统研究[D].华中科技大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2013,硕士.
[32]邵华,赵宏.一种与神经元网络杂交的决策树算法[J].小型微型计算机系统,2001,08:964-966.
[33]康蓉.碳纳米管突发污染的应急混凝处理技术研究[D].哈尔滨工业大学,2014.
[34]蒋红红.跨文化视角中的中国民俗文化词语汉英翻译研究[D].福建师范大学,英语语言文学,2004,硕士.
[35]陈传飞.基于复杂网络的银行间市场网络流动性传导研究[D].南京大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[36]李钰.吉林省农户水稻销售行为及其影响因素研究[D].吉林农业大学,农村与区域发展,2012,硕士.
[37]李寿丽.过渡金属硼酸盐锂离子二次电池电极材料的制备及性能[D].山东大学,2013.
[38]王涛.一种MIMO通信平台的设计与实现[D].青岛理工大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[39]张云利,李文兵,胡宇,何佳毅.钢铁企业能源仿真场景编制系统的研究与实现[J].冶金自动化,2011,04:20-25.
[40]刘辰昊.基于DSP的大锻件尺寸在线测量系统的研究[D].太原科技大学,电力电子与电力传动,2014,硕士.
[41]朱亚地.高速PCB信号反射及串扰仿真分析[D].西安电子科技大学,精密仪器与机械,2012,硕士.
[42]于晓玲.吉林油田红岗采油厂作业成本管理研究[D].吉林大学,会计,2014,硕士.
[43]朱洪波.便携式多生理参数监护仪实时分析与软件设计[D].河北工业大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[44]杨建平.基于价值工程的综采系统分析与评价的研究[D].辽宁工程技术大学,采矿工程,2004,硕士.
[45]荆磊.东太湖湖滨湿地净化功能的示范研究[D].扬州大学,土壤学,2011,硕士.
[46]王秋贺.小波神经网络在防化电路故障诊断中的应用研究[D].东北大学,机械设计及理论,2010,硕士.
[47]王硕.温度处理对黑线仓鼠生理、行为的影响及其分子机制研究[D].曲阜师范大学,动物学,2013,硕士.
[48]谢苗苗.碳纳米管基超级电容器电极材料的制备及其电化学性能研究[D].哈尔滨工程大学,2012.
[49]王恩德,刘国斌.基于经济景气分析数据仓库的设计与实现[J].吉林大学学报(信息科学版),2005,04:416-422.
[50]马鸿伟.盐酸阿那格雷胶囊人体药代动力学研究[D].吉林大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.