家蚕肠道短小芽孢杆菌SW41脂肪酶基因的克隆、表达及酶活性分析

【摘要】家蚕是一类重要的经济资源昆虫,在国民经济中占有重要地位,而蚕病的发生一直困扰着蚕桑业的发展,尤其是家蚕核型多角体病毒病(BmNPV),它是蚕业生产中危害最为严重的一种病毒病。家蚕在长期的进化过程中,逐渐形成了些自我保护的免疫防御机制。日本学者发现家蚕中肠分泌的脂肪酶对BmNPV且有强的抑制作用,国内一些学者克隆了家蚕肠道脂肪酶基因,发现其表达产物对BmNPV也有抑制作用。本研究室向芸庆等发现桑叶饲养蚕肠道菌种类比柘叶饲养蚕丰富,其肠道产生的优势菌也更为丰富；谢洪霞、薛英伟、王晓强等发现柘叶饲养蚕易感染BmNPV,且柘叶饲养蚕体内大部分抗BmNPV相关蛋白酶及家蚕抗逆性酶活性均有不同程度的下降；冯伟等从家蚕肠道优势菌中分离鉴定了9种产脂肪酶的细菌。综上,我们推测产脂肪酶的菌种可能与家蚕抗BmNPV有关。本研究旨在探讨家蚕肠道优势菌所产脂肪酶与BmNPV的关系,期望在家蚕新型饲料及抗病育种方面提供新的思路。本实验以来源于家蚕肠道的短小芽孢杆菌SW41菌株为试验材料,利用分子生物学相关技术,克隆了短小芽孢杆菌SW41的脂肪酶基因Lipase,与细菌其他种属的脂肪酶基因进行了比较分析,并将该基因连接到pColdI表达载体上,转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,进行了原核表达及其活性的检测。主要研究内容和结果如下：1.Lipase基因的克隆及生物信息学分析提取短小芽孢杆菌SW41菌株的基因组DNA,设计引物,PCR扩增获得脂肪酶基因Lipase的完整ORF,大小为648bp,共编码215个氨基酸,预测Lipase蛋白理论分子量为22.95kDa,等电点为9.92；在线预测其信号肽、跨膜域及N糖基化位点,发现Lipase蛋白N端前34个氨基酸含有它的信号肽序列,它没有跨膜域,且不存在N糖基化位点,因此Lipase蛋白为分泌型蛋白,非糖蛋白；二级结构预测发现其符合脂肪酶所特有的α/β折叠结构；结构域预测发现Lipase蛋白属于α/β水解酶家族,并具有脂肪酶家族的保守序列。亲缘关系分析表明,家蚕肠道菌短小芽孢杆菌SW41的脂肪酶可能具有抑制BmNPV的潜力。2.Lipase基因的原核表达及Western鉴定将Lipase基因ORF全长片段连接到线性化的pColdⅠ表达载体上,经菌液PCR和质粒双酶切鉴定获得了pColdⅠ-Lipase原核重组表达载体,转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,在15℃,100rpm,1mMIPTG的条件下诱导24h,SDS-PAGE检测发现该蛋白以可溶、包涵体及分泌性三种形式表达。利用westernblotting方法鉴定该蛋白,确定该蛋白为目的蛋白脂肪酶。3.重组脂肪酶活性的检测采用罗丹明B平板法初步检测重组脂肪酶活性,采用对硝基苯芬法测定重组脂肪酶活力。罗丹明B平板法结果显示：涂布有重组脂肪酶粗酶液的培养基上长出了单菌落,对照组均无菌落长出；紫外光激发下发现菌落显示出橘黄色的荧光,说明脂肪酶的存在并具有一定的活性；对硝基苯芬法测定结果显示：粗酶液中重组脂肪酶的酶活力为14.72U/mL,两种方法的检测都表明重组脂肪酶具有一定的活性。采用BCA法对脂肪酶粗酶液蛋白含量进行测定,发现其蛋白浓度为0.09mg/mL。旨肪酶活性的确定为后续该酶在功能方面的研究奠定了基础。
【作者】范蕊；
【导师】万永继；
【作者基本信息】西南大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】短小芽孢杆菌SW41；脂肪酶；原核表达；Westernblotting；活性；

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