UBE3C在原发性肝癌中的突变及生物学特性研究

【摘要】原发性肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)在全球常见恶性肿瘤中居第六位,在肿瘤相关性死亡中居第三位。据最新统计,全球每年约有74.8万新发肝癌病例,约有75万人死于肝癌,其中半数发生在中国。虽然在肝癌早期诊断、手术切除、肝脏移植方面取得了诸多进步,肝癌患者的生存率得到提高,但肝癌患者的总体预后仍然很差。肝癌的发病机制至今仍不十分清楚,与之相关的易感基因也很缺乏。因此,肝癌相关的新的易感基因的发现将为肝癌的预防、高危人群的筛查和早期诊断提供生物学标志,并为开发全新的药物和基因治疗提供靶点。肿瘤的发生是个复杂的生物学过程,基因变化引起的原癌基因的活化和抑癌基因的失活是其核心。与其他实体肿瘤类似,HCC在其自身发生、发展过程中亦累积了大量遗传变异,这些遗传变异逐渐累积形成癌前病变并最终演进为肿瘤。现已知道,HCC的形成是一个多因素、多步骤的组织学发展过程。大部分HCC发生在由各种原因导致的肝硬化背景上,由慢性乙型或丙型肝炎—异型增生结节(DysplasticNodules,DN)-HCC逐渐演化、发展而来。因此,通过对比正常细胞基因组、DN基因组和HCC基因组遗传变异之间的差异,可以发现与HCC相关的较早期遗传变异。近年来,新一代测序技术(Next-generationsequencing)的进步,促进了全基因组测序和全基因组外显子测序的快速发展,并被广泛运用于复杂疾病如癌症易感基因的研究和临床诊断中。外显子区域包含着合成蛋白质所需要的信息,涵盖了与个体表型相关的大部分功能性变异,同时外显子区域是目前基因组中被研究得最为成熟的一部分,使得我们能够对发现的变异所在的基因进行注释和功能途径分析。由于外显子仅占整个基因组的1%左右,因此远比进行全基因组序列测序更经济、高效。由于其具有对常见和罕见变异高灵敏度,能发现外显子区绝大部分疾病相关变异,促使全外显子测序成为鉴定孟德尔疾病的致病基因最有效的策略,也被广泛运用于复杂疾病如癌症易感基因的研究和临床诊断中。本研究旨在通过对正常细胞基因组DNA、DN基因组DNA以及HCC基因组DNA进行全外显子测序分析,寻找与肝癌有关的新的遗传变异位点,并对筛选出的候选基因进行相应的功能研究。第一部分全外显子测序寻找肝癌相关遗传变异位点摘要目的：通过对一例原发性肝癌病人的外周血淋巴细胞、肝脏异型增生结节(DysplasticNodules,DN)和两个肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)组织共4个样本进行外显子测序分析,寻找与肝癌相关的新的遗传变异位点。方法：应用AliglentSureSelect人外显子序列捕获(50M)系统和Solexa测序技术,检测肝脏DN和HCC外显子区域的变异位点,通过比对外周血正常淋巴细胞外显子区域的变异和NCBI的dbSNP数据库,过滤掉共有的体细胞SNP变异,从而筛选出肝癌相关的遗传变异位点,并应用Sanger法测序技术对所筛选出的位点进行验证。结果：在DN中共发现5个新的单核苷酸变异(SingleNucleotideVariations,SNV),在两个HCC中分别发现72个和182个新的SNVs。其中两个HCC均有SNVs的基因共两个,分别为位于7号染色体上的UBE3C基因和19号染色体上的MUC16基因,均经过Sanger测序法证实突变。在DN与HCC上均有SNVs的基因没有发现。此外,在DN中未发现新的短插入／缺失(Smallindel)变异,在两个HCC中分别发现3个和9个新的Smallindel变异,分别定位在12个不同的基因上结论：肝脏DN与HCC未发现共有变异基因,但两个HCC中均发现基因UBE3C和MUC16存在变异,提示这两个基因可能与肝癌发生密切相关。第二部分候选基因UBE3C的验证及结构分析摘要目的：探索泛素连接酶E3C(UBE3C)在原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)病例中的突变情况。方法：在另一组105例HCC样本中,应用常规Sanger测序技术对UBE3C的全部23个外显子区域进行测序,并分析UBE3C基因突变与肝癌临床病理因素之间的关系。结果：在全部106例(包含全外显子测序1例)HCC样本中,共有17例在UBE3C上存在碱基置换的非同义突变,基因突变率16.0%。这些突变位点分别位于UBE3C的5、7、13、20和22号外显子上,其中Asn929I1e、G1u959Lys和Thr1004Ala三个位点的突变发生在UBE3C的进化上高度保守的HECT结构域(domain)上。统计分析结果表明,UBE3C突变与患者性别、年龄、HBVDNA、肝硬化、肿瘤大小、包膜、分化及血管侵犯及肿瘤TNM分期等临床病理因素均无关。结论：UBE3C在HCC病例中存在多位点、高频率的突变,Asn929Ile、Glu959Lys和Thr1004A1a的突变可能会对UBE3C的蛋白质功能产生重要影响,参与HCC的发生、发展过程。第三部分UBE3C的肿瘤生物学特性研究摘要目的：研究泛素连接酶E3C(UBE3C)在各种肝癌细胞系和肝癌组织的表达情况,并探索其对人肝癌细胞株Huh7和MHCC97-H生长增殖及侵袭的影响。方法：选用正常肝细胞系L-02和常见的肝癌细胞系SMMC-7721、Huh7、Hep3B、HCCLM3、MHCC97-H和MHCC97-L共7种不同的人肝癌细胞系,通过Westernblot方法检测上述细胞系中UBE3C蛋白表达及分布情况。应用免疫组化方法观察UBE3C在人肝癌组织及癌旁组织中的表达情况。通过构建稳定敲减UBE3C的Huh7和MHCC97-H细胞株,观察在敲减UBE3C后肿瘤细胞的生长增殖、迁移及侵袭能力的变化。结果：UBE3C在各肝癌细胞系中均有表达,且主要分布在细胞质中,在相对正常的L-02细胞中表达水平较低,而在具有较高侵袭潜能的MHCC97-H细胞和相对较低侵袭潜能的Huh7细胞系中则表达水平较高。在人肝癌组织标本中,UBE3C蛋白主要存在于肿瘤细胞的胞浆中,且在癌组织中的表达水平高于癌旁组织。在人肝癌细胞系Huh7和MHCC97-H中敲减UBE3C基因后,肿瘤细胞的体外生长增殖能力、迁移和侵袭能力均较对照组明显减弱。结论：UBE3C可促进肿瘤细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力,在HCC中可能发挥着促癌作用,是一个HCC相关的潜在的癌基因。
【作者】蒋家好；
【导师】周俭；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】原发性肝癌；人肝癌细胞系；UBE3C；肝癌发生；癌症易感基因；肿瘤相关基因；测序技术；变异基因；原发性肝细胞癌；测序法；

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