蟾毒它灵对恶性胶质瘤的作用及机制的研究

【摘要】第一部分蟾毒它灵在体外对人胶质瘤细胞的生长抑制作用的评价目的：在体外培养环境下,了解蟾毒它灵对人胶质瘤细胞的增殖抑制作用及IC50浓度区间,初步了解蟾毒它灵对U87细胞侵袭能力和细胞周期的影响。方法：运用XTT法测定蟾毒它灵对U87、U251胶质瘤细胞系生长抑制的量-时-效关系。运用XTT法分别测定不同浓度蟾毒它灵作用于原代培养的人胶质瘤细胞Jz001和JZ002以及人胶质瘤细胞株U87和U251的72小时生长抑制率。正规几率单位法计算蟾毒它灵对每种细胞的IC50。TRANSWELL法测定不同浓度蟾毒它灵对U87细胞侵袭能力的影响。流式细胞技术测定不同浓度蟾毒它灵对U87细胞周期的影响。结果：药物干预后24、48和72小时,各浓度蟾毒它灵对人胶质细胞的增殖抑制作用趋势接近。在体外培养环境下,不同浓度的蟾毒它灵作用72小时对人脑胶质瘤细胞生长抑制活性有较大差异,对Jz001的IC50为0.063ug/ml,对JZ002的IC50为0.084ug/ml,对U87的IC50为0.071ug/ml,对U251的IC50为0.145ug/ml。2-5ug/ml的蟾毒它灵就能明显降低U87细胞的侵袭能力。2-2ug/ml蟾毒它灵作用24小时可以使U87细胞G2期和S期细胞比例明显提高。结论：蟾毒它灵在体外对多种人胶质瘤细胞均有很强的增殖抑制活性,蟾毒它灵对人胶质瘤细胞的生长抑制作用有明显的剂量依赖性而时间相关性不明显。U87细胞的侵袭能力和蟾毒它灵的浓度呈负相关。蟾毒它灵可以通过G2/M期、S期细胞周期阻滞对胶质瘤细胞发挥增殖抑制作用。第二部分蟾毒它灵对人胶质瘤动物模型的抗肿瘤效果研究目的：建立U87原位种植动物模型。了解经血管给药后,不同时间点蟾毒它灵在小鼠脑内的分布情况；比较蟾毒它灵和阳性对照药物替莫唑胺对U87荷瘤小鼠的疗效优劣。方法：采用高效液相色谱法测定经尾静脉给药后不同时间点(15min、30min、1小时、2小时、4小时、8小时、16小时和24小时)的小鼠脑组织内蟾毒它灵含量的变化；立体定位注射技术建立U87原位种植裸鼠模型,并分为对照组、实验组和阳性对照组。对照组(n=15)给予每周两次尾静脉注射药物溶剂、实验组(n=14)给予每周两次尾静脉注射6mg/Kg蟾毒它灵,阳性对照组(n=18)给予每日腹腔注射82.5mg/Kg替莫唑胺连续5天。治疗开始后定期观察小鼠体重变化,通过定期的增强磁共振扫描了解不同干预下活体内肿瘤生长的差异,根据生存情况绘制生存曲线,比较不同干预对荷瘤小鼠生存时间的影响。组织学和免疫组化染色验证不同干预对肿瘤的作用。结果：成功建立了U87原位异体种植裸鼠模型。经尾静脉给药后不同时间点蟾毒它灵在小鼠脑内的含量测定表明,静脉给药后蟾毒它灵能通过血脑屏障进入脑组织,并维持在0.1μg/g的浓度之上超过16小时。阳性对照组小鼠在治疗开始后1周左右的时间内,平均体重呈进行性下降,停用TMZ后体重逐渐恢复,对照组和实验组小鼠的平均体重在术后2周左右开始出现进行性下降。定期的增强磁共振扫描发现对照组和实验组肿瘤逐渐增大,而阳性对照组在4周内未发现明显强化的肿瘤信号。根据荷瘤小鼠生存情况绘制生存曲线发现,对照组中位生存时间为21天,实验组中位生存时间25天,比较两组生存时间存在统计学差异(P=0.038),阳性对照组观察超过4周无组内样本死亡。结论：成功建立了稳定的U87原位异体种植裸鼠模型,该模型方法便捷,成瘤率稳定,是很好的评价化疗药物体内效果的动物模型。静脉注射蟾毒它灵在小鼠脑内分布良好,并且能够长时间维持有效的治疗浓度。增强磁共振扫描是一种安全直观的活体观察荷瘤小鼠脑内肿瘤生长情况的方法。蟾毒它灵单独应用可以延长荷瘤小鼠的生存时间。第三部分蟾毒它灵对人胶质瘤细胞增殖抑制作用机理的研究目的：初步探索蟾毒它灵抑制胶质瘤生长的作用机理以及胶质瘤对其耐药的机制。方法：采用TUNEL/PI双染法测定蟾毒它灵引起的DNA片段化；JC-1染色检测蟾毒它灵对线粒体膜电位的影响；Western-Blot技术检测蟾毒它灵对细胞内凋亡相关蛋白caspase-3pro-form、caspase-8、caspase-9、p53以及survivin含量的影响。对第二部分中实验组和对照组动物脑组织切片行IHC染色,观察P糖蛋白(P-Gp)的表达是否存在差异。结果：蟾毒它灵作用24小时即可引起胶质瘤细胞线粒体膜电位下降和DNA的片段化；蟾毒它灵作用36小时后即可使胶质瘤细胞进入不可逆的凋亡,细胞内凋亡执行酶Caspase-3前体的含量随蟾毒它灵的浓度升高而下降；代表死亡受体通路激活的Caspase-8和代表线粒体通路激活的Caspase-9的含量随蟾毒它灵的浓度增高而增高,p53和survivin在U87细胞中的表达相对较低,蟾毒它灵的浓度对这两种蛋白表达的影响不明显。IHC染色发现蟾毒它灵干预后胶质瘤细胞P-糖蛋白(P-Glycoprotein)的表达较对照组增高。结论：蟾毒它灵短时间作用就可以诱导胶质瘤细胞进入凋亡过程,并且死亡受体通路和线粒体通路都参与了这一凋亡诱导过程,p53和survivin可能没有参与蟾毒它灵诱导的凋亡过程。胶质瘤细胞对蟾毒它灵的耐药机制可能与药物外排增加有关。
【作者】高幸；
【导师】毛颖；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】恶性胶质瘤；蟾毒它灵；异体种植动物模型；替莫唑胺；化疗；凋亡；

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