乳腺癌和急性髓系白血病的靶向治疗

【摘要】背景及目的：在约25%的浸润性乳腺癌患者中,存在erbB2基因扩增和／或过表达,这与乳腺癌患者的不良预后密切相关。ErbB3受体在erbB2阳性乳腺癌中发挥重要作用,erbB3表达量的增加可引起对trastuzumab等治疗药物耐受的发生。我们之前研究显示,在对trastuzumab耐受的乳腺癌细胞中,erbB3可以与erbB2和IGF-1受体共同形成异源三聚体,从而介导对trastuzumab的耐受。因此,本实验旨在研究人源化erbB3抗体MM-121,在体外和体内对于erbB2阳性乳腺癌细胞的抗肿瘤作用。方法：MTS测定细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,WesternBlot检测处理后相关蛋白的表达量及活化状态的改变。用Trastuzumab耐受乳腺癌细胞BT474-HR20建立裸鼠皮下异位移植瘤模型,对成瘤裸鼠腹腔注射trastuzumab和/或MM-121,探寻MM-121和trastuzumab在体内的治疗作用。免疫组织化学法比较移植瘤的erbB3,erbB2,Ki67及活化型Caspase-3的表达在各个治疗组中的差异。结果：细胞增殖实验显示,在对trastuzumab敏感和耐受的乳腺癌细胞中,MM-121均显著地增强了trastuzumab介导的生长抑制。MM-121联合trastuzumab主要显著下调了磷酸化erbB3(P-erbB3)及其下游P-Akt的水平。在体外的细胞实验中,MM-121联合trastuzumab并未引起对trastuzumab耐受细胞的凋亡,而是导致了其细胞周期G1期阻滞,且伴随p27kipl的上调及E2F-1的轻微下调。有趣的是,在由trastuzumab耐受的乳腺癌细胞建立的裸鼠皮下异位移植瘤模型中,MM-121联合trastuzumab的作用明显优于任一单一处理,联合用药组显著地抑制了移植瘤的生长,且免疫组织化学结果显示Ki67的减少及活化型Caspase-3的增加与移植瘤的生长趋势相对应。以上结果显示,MM-121联合trastuzumab不仅抑制trastuzumab耐受细胞的生长,还能够在体内导致肿瘤细胞的凋亡。结论：本实验证明了MM-121联合trastuzumab在体外和体内都发挥了强有力的抗肿瘤作用。因此,MM121有望在对erbB2阳性且已经对trastuzumab产生耐受的乳腺癌患者的治疗中发挥作用。背景及目的：Survivin(由BIRC5基因编码)是哺乳动物凋亡抑制蛋白家族(inhibitorofapoptosisproteins,IAP)最小的成员,具有抗凋亡和调节细胞周期的双重功能。Survivin在胚胎发育过程中表达,而在成熟分化的组织和细胞中表达很少,但在很多肿瘤细胞中存在survivin高表达的情况,survivin的高表达同肿瘤的不良预后、复发以及对治疗的耐受等密切正相关。Survivin在正常造血过程中发挥重要功能,而在很多血液系统肿瘤中均有survivin表达增高并与不良预后相关的报道。对急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia,AML)患者的研究显示,survivin的高表达与AML患者的不良预后密切相关。目前对于靶向下调survivin治疗AML的研究还很有限,靶向下调survivin后AML对化疗药物的反应也还不清楚。本文希望通过应用shRNA沉默survivin在AML细胞中的表达,研究survivin对于AML细胞的作用及其对化疗药物敏感性的影响,同时研究survivin的小分子抑制剂YM155作为单药以及联合其他化疗药物对于AML的治疗作用。希望通过该研究为临床对AML进行survivin靶向治疗提供理论依据。方法：半定量PCR和实时荧光定量PCR检测AML细胞系中survivinmRNA表达水平；VVesternblot检测AML细胞survivin蛋白表达水平,以及对细胞进行处理后相关蛋白表达量或活化水平的改变；细胞死亡相关酶联免疫吸附反应定量检测处理后细胞死亡情况；流式细胞术检测AML细胞在survivin特异性沉默后或YM155处理后细胞周期改变；细胞增殖实验(MTS)用于检测survivin特异性沉默后细胞的增殖速度,以及化疗药物、YM155单独或联合使用时对AML细胞增殖能力的影响。结果：在所检测的AML细胞系中,Kasumi-1和HL-60细胞survivin表达量最高。利用survivin特异的shRNA沉默Kasumi-1和HL-60细胞中survivin的表达后：细胞增殖实验显示细胞增殖受抑制；流式细胞术分析发现细胞周期G2/M期阻滞；Westernblot显示DNA损伤和细胞凋亡蛋白水平增加；细胞死亡相关酶联免疫吸附反应同样显示细胞凋亡水平增加。利用survivin特异的shRNA沉默Kasumi-1和HL-60细胞中survivin的表达后,联合化疗药物：与对照组相比,Westernblot显示药物处理后survivin沉默组DNA损伤和细胞凋亡蛋白水平增加。利用survivin的小分子抑制剂YM155处理Kasumi-1和HL-60细胞后,可引起：survivin表达量呈剂量和时间依赖性降低,细胞呈现剂量和时间依赖的凋亡。YM155联合化疗药物处理AML细胞,细胞增殖实验检测发现YM155与化疗药物联合,可以呈现出相互协同的作用,也可以表现为相互拮抗,依赖于具体药物和所作用的细胞。结论：本实验证明了survivin对于AML细胞的增殖和维持具有重要作用,在AML细胞中特异性沉默survivin可以提高其对于化疗药物的敏感性,survivin的小分子抑制剂YM155对AML细胞中survivin的表达降低和细胞凋亡作用呈剂量和时间依赖,YM155与化疗药物联合作用时,联合用药效果依赖于具体药物和所作用的细胞。本文为使用survivin作为AML治疗的靶点提供了新的思路和策略,为今后体内及临床试验的开展提供了依据。
【作者】黄菁草；
【导师】王建祥；柳柏林；
【作者基本信息】北京协和医学院，内科学，2014，博士
【关键词】MM-121；erbB3；erbB2；trastuzumab耐受；乳腺癌；survivin；靶向治疗；YM155；化疗敏感性；急性髓系白血病；

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