碳青霉烯类耐药斯坦利沙门菌的发现及其耐药机制研究

【摘要】抗生素无疑是20世纪最伟大的发现之一,挽救了无数患者的生命。但是由于目前临床医疗及其他领域抗菌药的大量应用,导致细菌耐药性急剧增加,多重耐药细菌层出不穷,给临床治疗带来巨大的挑战。细菌产水解抗菌药的酶是主要耐药机制之一。肠杆菌科细菌作为临床上主要的病原菌,产ESBLs及AmpC酶是耐β-内酰胺类抗生素的主要机制,其中碳青霉烯类抗生素对ESBLs及AmpC酶稳定,是治疗这些多重耐药菌感染的主要药物。近几年,碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的不断出现,对全球人类健康造成严重威胁。只有极少数的抗生素如多粘菌素、替加环素、磷霉素等可能对碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌有效。2009年报道发现编码一种新碳青霉烯酶的基因blaNDM1,由于携带该基因的细菌耐药性强,呈洲际传播,被称为“超级细菌”,令全世界为之恐慌。深入研究NDM-1,掌握其特点,对于治疗及控制传播有重要意义。沙门菌病(salmonellosis)是一种重要的人畜共患病,沙门菌是其病原菌。沙门菌作为最重要的食源性传染病病原菌之一,常导致爆发流行。自1885年Salmon和Smith分离到猪霍乱沙门菌以来,对沙门菌的研究历史己有100多年。目前,己发现的沙门菌的血清型有2000多种。抗生素的应用对控制和预防沙门菌病发挥了巨大的作用,然而随着抗菌药的滥用和不当使用,沙门菌的耐药性日趋严重,表现为多重耐药甚至碳青霉烯类耐药。2011年美国科学家在一位从印度转送至美国就医的患者的直肠拭子中分离到产NDM-1亚胺培南耐药沙门菌；2012年9月法国微生物工作者再一次在一位从印度转送至法国就医的患者尿液中分离到产NDM-1沙门菌,此两株沙门菌均在细菌监测过程中发现,当时并未造成感染。虽然目前碳青霉烯类耐药沙门菌鲜有报道,但是由于沙门菌传染性强,一旦耐药细菌及耐药基因的传播,将严重危害人类的健康,因此沙门菌的耐药性上升更加受到关注。课题组首次从一位高热伴腹泻患儿的粪便中培养到碳青霉烯类耐药沙门菌。本课题对碳青霉烯类耐药沙门菌感染患者的临床资料进行分析,对耐药质粒全序列进行测定,进一步研究耐药机制及耐药传播特点,为耐药菌感染的防治提供依据。第一部分碳青霉烯类耐药斯坦利沙门菌的发现患儿因发热6天伴粘液血便3天入院,入院前先后予哌拉西林他／唑巴坦及头孢西丁治疗4天未见明显好转,最高体温39℃～40℃,入院后大便培养到沙门菌,血清凝集试验确定为斯坦利沙门菌,该菌表现为对p-内酰胺类抗生素包括碳青霉烯类和酶抑制剂复合制剂耐药,对米诺环素、氯霉素、磷霉素、环丙沙星、左氧氟沙星及阿奇霉素等敏感。患儿入院后应用阿奇霉素治疗,住院5天后康复出院。在出院3个月后的随访中,患儿及密切接触家属的大便未培养到碳青霉烯类耐药沙门菌。对患儿的居住地及喂养史进行调查未发现特殊情况,经初步调查,病例为散发。应用多位点基因序列分型(MLST)方法确定该菌为ST29。未发现该菌与印度大陆有直接联系。第二部分碳青霉烯类耐药斯坦利沙门菌的耐药机制及耐药性传播特点碳青霉烯类耐药沙门菌金属p-内酰胺酶检测为阳性,改良Hodge试验表现弱阳性,经PCR扩增及序列测定,证实该菌携带了耐药基因blαNDM-1。通过接合试验,碳青霉烯类耐药性成功地传递给大肠埃希菌C600及肺炎克雷伯菌13883,接合效率为10-7～10-4/15分钟,接合子耐药表型与斯坦利沙门菌临床株一致,接合子与临床株(供体菌)的质粒大小相同,该质粒命名为pHS36-NDM,质粒分型为IncA/C。以质粒V517、R1及R27为参照,初步测定该质粒DNA序列全长约140kb。为了解NDM-1及其携带质粒的稳定性,将携带blαNDM-1的细菌分别在无抗性的LB液体培养基中传代14天,培养温度为37℃,每天随机各测定20个克隆对碳青霉烯类的敏感性。碳青霉烯类耐药斯坦利沙门菌在无抗性传代的第3天及第9天分离到3株blαNDM-1阴性的碳青霉烯类敏感斯坦利沙门菌,未抽提到pHS36-NDM质粒,考虑为质粒丢失。丢失pHS36-NDM质粒的沙门菌恢复对β-内酰胺类抗生素的敏感性。接合子在传代14天未分离到丢失碳青霉烯类耐药性的菌株。生长曲线测定显示,携带pHS36-NDM质粒的菌株与丢失该质粒的菌株无明显差别。第三部分pHS36-NDM质粒序列研究及NDM-1生物信息学分析使用新一代高通量测序技术对pHS36-NDM质粒序列进行测定,结果显示,该质粒全长为138,001bp,平均G+Cmol%值为约52%。经NCBI网站ORFFinder软件分析确定其编码序列即ORF为763个,通过与公共数据库比对,发现可以识别功能的ORF有170个。发现质粒pHS36-NDM结构特点：1.存在编码IV型接合转移系统蛋白基因traA,traB,traC,traD,traE,traF,traG,traH,traI,traK,traL,traW,traU,traN,traV等,表明该质粒具有水平转移能力；2.具有StbA基因编码质粒稳定蛋白,提示与pHS36-NDM质粒稳定性有关；3.具有多种与基因转移相关的插入序列、整合酶、转座子基因结构包括ISEcpl、IS4321、Tn1696、intl1、ISKpnl4、ISAb125和ISCR27,表明质粒具有强大的可塑性；4.携带耐药基因Sull,blαCMY-6,blαNDM-1,介导的耐药性与药物敏感性试验结果相符。此外,该质粒序列中存在与质粒复制和转移调控以及蛋白质表达等有关的重复序列,推测这些序列对调控质粒的拷贝数有一定意义。pHS36-NDM全序列及blαNDM-1基因两端结构与分离自意大利的大肠埃希菌、分离自加拿大的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌携带质粒上blαNDM-1基因的周边结构高度一致性,但没有明确的证据表明细菌这些国家间传播；与印度分离的肺炎克雷伯菌的blαNDM-1基因两端结构相似度较低。推测在环境中存在该核酸片段,在物种进化及抗生素压力选择下,细菌可整合该片段以适应环境的变化。应用生物信息学分析工具得出NDM-1蛋白的理化性质,软件推测NDM-1的分子式为C1256H1973N353O377S14由269个氨基酸组成,相对分子量28KDa,等电点为5.88,疏水性GRAVY的值为0.010。NDM-1结构域氨基酸位置：74-250,属于FamilyLactamase_B(PF00753)蛋白质家族。氨基酸序列进行比对,发现NDM-1与其他碳青霉烯酶的同源性不高,同源性最高为VIM,约32%。结论1.首次在肠道感染患儿粪便中分离到携带blαNDM-1的碳青霉烯类耐药斯坦利沙门菌,该菌株的MLST分型为ST29。该菌对为p-内酰胺类抗生素包括p-内酰胺酶抑制剂合剂和碳青霉烯类耐药,但对阿奇霉素、环丙沙星及米诺环素敏感；由于产NDM-1沙门菌改良Hodge试验弱阳性,临床检测时容易漏检。2.blαNDM-1基因位于可转移的IncA/C型pHS36-NDM质粒上,耐药质粒以高接合频率转移至大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌。IncA/C型质粒是携带blαNDM-1基因的重要载体。pHS36-NDM质粒在菌株传代中稳定、不易丢失,这一特性是其加速耐药性传播的重要基础。3.pHS36-NDM质粒全长为138kb,质粒中包含与质粒接合转移相关的多个基因；与耐药基因摄入、转移相关的多种基因或插入序列；与质粒稳定性相关基因stbA;除blαNDM-1外,尚携带耐药基因Bull及blαCMY-6。全序列及blαNDM-1基因两端结构与印度新德里分离的携带blαNDM-1质粒及其两端序列差别较大；与世界上其他多个国家和地区的细菌中携带blαNDM-1质粒序列同源性较高。
【作者】黄金伟；
【导师】王明贵；
【作者基本信息】复旦大学，病原生物学，2013，博士
【关键词】碳青霉烯类抗生素；沙门菌；耐药机制；

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