子痫前期肾损伤标志物及Ang-（1-7）对其足细胞损伤保护作用的研究

【摘要】第一部分子痫前期肾损伤的临床研究(一)子痫前期相关危险因素研究目的通过对临床病例收集整理及生化指标的检测,研究子痫前期患者危险因素及其与子痫前期发病率的相关性。探讨不同危险因素对子痫前期患者以及围生儿不良妊娠结局的影响。方法收集2011年5月-2012年3月在复旦大学附属上海市第五人民医院住院分娩的正常妊娠孕妇、妊娠期高血压孕妇及子痫前期患者各25例。检测产前产后血压、肾功能、肝功能、血尿常规、尿白蛋白、尿肌酐、血脂、超敏C反应蛋白、免疫指标、凝血功能等指标。观察子痫前期发生的可能机制及独立危险因素。结果1、与正常妊娠组比较,子痫前期组年龄,分娩孕周,体重,BMI均有明显差异,剖宫产、水肿及经产妇比例均较正常妊娠组高；分娩后5min、分娩后2h的收缩压及舒张压升高；血尿素氮、肌酐、尿酸、丙氨酸转移酶升高；以MDRD公式计算eGFR的结果及CKD-EPI公式计算的eGFR的结果、总蛋白、白蛋白、球蛋白、A／G下降；IgG、C4(P<0.05),与正常妊娠组及妊娠期高血压组比较,子痫前期24小时尿蛋白定量、尿微量白蛋白、尿ACR升高,差别有统计学意义(P<0.001)。与妊娠期高血压组比较,子痫前期组分娩孕周、总蛋白、白蛋白,差别有统计学意义(P<0.05)。血压、肾功能,血脂、凝血功能、免疫指标均有变化,但差别无统计学差异。2、研究发现子痫前期组较正常妊娠组早产儿、低体重儿比例高,其中体重、身长差别具有统计学意义(P<0.001),Apgar评分较正常妊娠组下降,但差别无统计学意义。3、通过二分类多因素logistic回归分析显示孕妇年龄≤20岁或≥33岁、高血压家族史、水肿、丙氨酸转移酶、白蛋白水平降低、是子痫前期发生的危险因素是子痫前期发生的独立危险因素。结论肾功能中肌酐、尿素氮、尿酸、尿白蛋白、尿ACR及年龄、BMI、高血压家族史、水肿、丙氨酸转移酶、白蛋白、IgG、C4的变化与子痫前期的发生有关系。子痫前期患者胎早产及低出生体重的概率明显增加,母婴不良结局的发生率明显增加。年龄过大或过小、高血压家族史、水肿、丙氨酸转移酶升高、低白蛋白血症是子痫前期发生的独立危险因素。(二)子痫前期肾损伤标志物的研究目的通过检测和统计分析正常孕妇、妊娠期高血压患者及子痫前期患者的血清和尿液相关指标、肾功能水平及肾损伤标志物水平,寻找子痫前期肾损伤的敏感因子,以期早期发现肾损伤,早期治疗。方法选自从2011年5月-2012年3月在复旦大学附属上海市第五人民医院住院分娩的正常孕妇、妊娠期高血压孕妇及子痫前期患者各25例。分别检测产前和产后血压、肾功能及肾损伤标志物(血清CystatinC、RBP、NGAL、IL-18,尿KIM-1、RBP、NGAL、IL-18)水平。结果1、与正常妊娠组比较,子痫前期患者的尿RBP、血CystatinC、血NGAL、尿NGAL、尿IL-18、尿KIM-1水平显著升高,差别有统计学意义(P<0.05)。2、与正常妊娠组比较,研究发现子痫前期患者的血RBP、血IL-18下降,但差别无统计学意义(P>0.05)。3、血RBP、尿RBP、尿NGAL与血肌酐成显著正相关,血IL-18与血肌酐、尿ACR成显著负相关,血CystatinC、尿IL-18、血尿NGAL与尿ACR成显著正相关(P<0.05),但相关关系均不密切(r<0.5)。4、尿RBP、尿KIM-1与尿ACR成显著正相关(P<0.01),且相关关系密切。血CystatinC、尿KIM-1、血NGAL、尿IL-18与血肌酐成显著正相关(P<0.05),且相关关系密切(r>0.5)。5、血RBP与血肌酐、尿ACR无明显相关性(P＞0.05)。6、肾损伤标志物血CystatinC、尿RBP、尿NGAL、尿KIM-1的最佳截断值分别为CystatinC<0.935mg/1,尿RBP<0.600mg/1,尿NGAL<39.889ng/ml,尿KIM-1<1.6432ng/ml.灵敏度和特异度分别为80%/64%,80%/78%,70%/90%,80%/80%。7、肾损伤标志物血CystatinC、尿RBP、尿NGAL、尿KIM-1两两联合,灵敏度和特异度分别为：96%/49.92%(血CystatinC与尿RBP联合)；94%/57.60%(血CystatinC与尿NGAL联合)；96%/51.20%(血CystatinC与尿KIM-1联合)；94％70.20%(尿RBP与尿NGAL联合),96%/62.40%(尿RBP与尿KIM-1联合),94％/72％(尿NGAL与尿KIM-1联合)。三个指标联合,血CystatinC+尿RBP+尿KIM-1联合,灵敏度92%,特异度为88%；血CystatinC+尿NGAL+尿KIM-1联合,灵敏度94%,特异度为80%；血CystatinC+尿RBP+尿NGAL联合,灵敏度90%,特异度为72%；尿RBP+尿.NGAL+尿KIM-1联合,灵敏度94%,特异度为94%；血CystatinC+尿NGAL+尿RBP+尿KIM-1,灵敏度100%,特异度为98.20%。结论1、子痫前期肾损伤标志物血CystatinC、血NGAL、尿RBP、尿NGAL、尿IL-18、尿KIM-1显著升高。子痫前期患者血CystatinC、尿KIM-1、血NGAL、尿IL-18与血肌酐关系密切,尿RBP与尿ACR关系密切。2、子痫前期肾损伤标志物血CystatinC、尿RBP、尿KIM–1的灵敏度最高,KIM-1的特异度最高。子痫前期肾损伤标志物两个指标联合时,尿NGAL与尿KIM-1灵敏度及特异度最高；三个指标联合时,尿RBP+尿NGAL+尿KIM-1灵敏度和特异度为最高；血CystatinC+尿NGAL+尿RBP+尿KIM-1联合诊断子痫前期的灵敏度100%,特异度为98.20%。每二部分子痫前期肾损伤的实验研究目的观察在子痫前期疾病形成过程中,足细胞凋亡是否参与肾脏损伤,探讨足细胞损伤的可能机制,为子痫前期的发生寻找新的作用机制,为临床防治子痫前期探索新的理论和实验基础。方法通过体外培养条件永生化小鼠足细胞株,用正常孕妇、妊娠期高血压患者及子痫前期患者血清干预足细胞24h,收集细胞,观察细胞形态变化,行台盼蓝、CCK8检测细胞活性、Annexin-V检测细胞凋亡情况,行Real-timePCR检测足细胞podocin及Mas受体mRNA表达情况,行Western-Blot检测足细胞标志蛋白podocin、WT1及Mas受体蛋白含量的变化情况。结果1、足细胞结构的改变：足细胞经不同血清刺激干预后,Leica倒置显微镜观察发现经子痫前期组刺激的足细胞体积减小,排列紊乱,胞体萎缩,足突减少缩短,二级结构消失,部分细胞脱落。2、台盼蓝法检测细胞活性：不同患者血清干预足细胞后,经台盼蓝染色,研究显示,子痫前期血清干预组与正常足细胞组、正常孕妇血清干预组比较,差别有统计学意义(P<0.001)。与妊娠期高血压孕妇血清干预组比较,细胞活性下降,差别有统计学意义(P<0.01)。3、CCK8检测细胞活性：通过CCK-8法检测细胞活性,用酶标仪测定在450nm处的吸光度。子痫前期血清干预组与正常足细胞组比较,差别有统计学意义(P<0.05),子痫前期与正常孕妇及妊娠期高血压干预组比较,差别无统计学意义。4、AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡：利用流式细胞仪或荧光显微镜检测细胞凋亡的发生。流式细胞仪分析显示子痫前期患者足细胞凋亡比例最高,与正常足细胞组、正常妊娠组及妊娠期高血压血清干预组比较,子痫前期血清干预组细胞凋亡比例明显增加,差别有统计学意义(P<0.001)。荧光显微镜下观察子痫前期孕妇血清干预的足细胞凋亡数目最多。5、Realtime及WesternBlot结果：通过Realtime及WesternBlot检测相关mRNA及蛋白质研究发现,子痫前期血清干预组与正常未干预组比较,podocinmRNA表达下降(P<0.05),MasmRNA表达下降(P<0.01),子痫前期组与正常孕妇血清干预组比较,podocinmRNA表达无差异,MasmRNA表达下降(P<0.01),子痫前期组与妊娠期高血压组比较,podocin及MasmRNA的表达均无明显差异。子痫前期组与正常未干预组及正常孕妇血清干预组比较,WT1蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.001),与正常未干预组及正常孕妇血清干预组比较,子痫前期组podocin、Mas蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.01),与妊娠期高血压组比较,子痫前期组Mas、podocin、WT1蛋白表达均下降,但差异均无统计学意义(P>0.05)。结论足细胞损伤参与到子痫前期的发病过程中,子痫前期患者血清干预足细胞可以引起足细胞的凋亡增加。子痫前期患者血清可使足细胞podocin、MasmRNA及podocin、WT1及Mas蛋白表达含量下降。足细胞存在Mas受体,子痫前期患者血清干预可使Mas表达含量下降,Mas含量的下降可能在子痫前期患者肾脏损伤中起重要作用。第三部分Ang-(1-7)对子痫前期肾损伤的保护作用的实验研究目的：研究不同浓度Ang-(1-7)水平对子痫前期肾脏足细胞的保护性作用,以期为临床治疗子痫前期肾损伤探索新的理论和实验基础。方法：足细胞分化成熟后,以不同浓度Ang-(1-7)(10-5,10-6、10-7mol/L)加入子痫前期患者血清培养的足细胞中,干预培养24h后观察细胞形态并收集细胞。台盼蓝、CCK8检测细胞活性、Annexin-V检测细胞凋亡情况,Realtime及Western检测相关基因及蛋白的表达。结果：1、台盼蓝法检测细胞活性：各组足细胞经台盼蓝染色后,与子痫前期血清干预组比较,子痫前期孕妇血清刺激+Ang-(1-7)10-6干预组差别活力细胞活性升高,差别有统计学意义(P<0.01)。子痫前期孕妇血清刺激+Ang-(1-7)10-5干预组及子痫前期孕妇血清刺激+Ang-(1-7)10-7干预组与子痫前期孕妇血清干预组相比,细胞活性升高,但差别无统计学意义。2、CCK8检测细胞活性：通过CCK-8法检测细胞活性,与子痫前期血清干预组比较,子痫前期孕妇血清刺激+Ang-(1-7)10-5干预组及子痫前期孕妇血清刺激+Ang-(1-7)10-6干预组与子痫前期血清干预组差别有统计学意义(P<0.05)。子痫前期孕妇血清刺激+Ang-(1-7)10-7干预组与子痫前期孕妇血清干预组相比,细胞活性升高,但差别无统计学意义。3、Annexin-V/PI检测细胞活性：利用流式细胞仪或荧光显微镜检测细胞凋亡的发生。研究显示,子痫前期孕妇血清刺激+Ang-(1-7)10-5干预组及子痫前期孕妇血清刺激+Ang-(1-7)10-6干预组与子痫前期血清干预组相比细胞活性升高,差别有统计学意义(P<0.05)。子痫前期孕妇血清刺激+Ang-(1-7)10-7干预组与子痫前期孕妇血清干预组相比,细胞活性升高,但差别无统计学意义。荧光显微镜下观察：子痫前期孕妇血清干预的足细胞凋亡数目最多,子痫前期孕妇血清刺激+Ang-(1-7)10-5干预组有早期凋亡细胞；子痫前期孕妇血清刺激+Ang-(1-7)10-7干预组早期凋亡及晚期凋亡细胞数目较子痫前期少,但比子痫前期孕妇血清刺激+Ang-(1-7)10-5干预组及子痫前期孕妇血清刺激+Ang-(1-7)10-6干预组凋亡细胞数目多。4、Realtime检测mRNA表达情况研究发现子痫前期孕妇血清刺激+Ang-(1-7)10-6较子痫前期组podocin、MasmRNA及podocin、WT1、Mas蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),子痫前期孕妇血清刺激+Ang-(1-7)10-5及子痫前期孕妇血清刺激+Ang-(1-7)10-7表达均较子痫前期组上升,但差别无统计学意义。结论：外源性给予Ang-(1-7)可以改善足细胞凋亡情况,Ang-(1-7)10-6为足细胞的保护的较适合浓度。
【作者】肖静；
【导师】顾勇；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2012，博士
【关键词】子痫前期；妊娠高血压疾病；危险因素；肾损伤标志物；足细胞；Ang-(1-7)；

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