非小细胞肺癌中TGFβRI基因异常表达的microRNA调控机制

【摘要】背景与目的：肺癌是世界范围内最常见的癌症，然而非小细胞肺癌（NSCLC）几乎占85%以上。TGFβRI在TGF-β信号通路的传导中起着重要作用，TGFβRI的表达异常会直接影响TGF-β信号的传导，进而影响癌症的生长与进展。目前虽然发现TGFβRI基因与NSCLC易感性相关，但基于TGFβRI异常表达的NSCLC表观遗传机制目前还不是很清楚。microRNA对基因表达的调节作用是通过与特定靶基因3’UTR种子序列的完全或不完全互补配来实现的。研究表明在癌症的发生和发展中检测到了microRNAs表达的改变。预测显示多个microRNAs可以靶向TGFβRI的3’UTR区域。本研究旨在探讨NSCLC中TGFβRI异常表达的microRNA调控机制，为NSCLC的早期诊断和治疗提供确凿的实验依据。方法：（1）Real-TimePCR和WesternBlot方法分别检测在人正常支气管细胞HBE和5株NSCLC细胞以及49对NSCLC组织样本中TGFβRI基因的mRNA和蛋白表达水平。（2）生物信息学软件预测分析能够靶向TGFβRI3’UTR区域的microRNAs，即microRNAs的初步筛选。然后合成microRNAs的模拟体mimics和microRNAsinhibitormimics，瞬时转染A549细胞，检测转染前后TGFβRImRNA和蛋白表达变化，筛选出可以改变TGFβRI基因表达的microRNAs。并且运用双荧光素酶活性检测实验验证相关microRNAs是否与TGFβRI3’UTR区域的种子序列直接结合，对初步筛选出的microRNAs进一步筛选。（3）qRT-PCR方法检测在人正常支气管细胞HBE、5株NSCLC细胞和49对NSCLC组织样本中最后筛选出的相关microRNAs的表达情况，并将其和TGFβRI的表达作回归分析，统计出NSCLC中TGFβRI和相关microRNAs表达的相关性。（4）构建最后筛选出的microRNAs的过表达载体和抑制载体，通过慢病毒Lenti-X表达系统筛选获得可以稳定高表达相关microRNA的A549细胞以及能持续低表达相关microRNA的单克隆A549细胞。并且运用Real-TimePCR和WesternBlot技术对筛选出的稳转细胞株进行鉴定，最后获得转染效率最佳的A549稳转细胞株，用无血清清的RPMI1640培养基饥饿培养过夜，然后用TGF-β1刺激A549细胞6h，最后检测TGF-β通路主要效应分子pSMAD3的表达。结果：（1）a、与HBE相比，TGFβR1mRNA和蛋白在NSCLC细胞株A549、LTEP-a-2、H1299和95C中的表达均是下降的。b、在49例NSCLC组织样本中TGFβR1mRNA表达下调（p<0.05）。c、在24例NSCLC组织中，TGFβR1蛋白表达水平较癌旁组织是下降的（p<0.05）。综上所述，TGFβR1基因在NSCLC中的表达是下降的。（2）生物信息学软件预测分析多个microRNAs可以与TGFβR1基因的3’UTR区域结合，通过microRNAs模拟体mimics瞬时转染以及DualLuciferaseReporterAssay实验验证，最后筛选出只有miR-142-3p可以影响TGFβR1基因的mRNA和蛋白表达并且这种作用是通过miR-142-3p与TGFβR1基因的3’UTR种子序列直接结合引起的。（3）与HBE相比，在NSCLC细胞株A549、LTEP-a-2、H1299和95C中miR-142-3p的表达是上升的。在49例NSCLC组织样本中miR-142-3p的表达也是上升的。也就是说，在NSCLC中miR-142-3p是高表达的。将其和TGFβRI的表达作回归分析发现NSCLC中两者的表达之间是负相关的。（4）成功构建稳定高表达miR-142-3p的A549稳转细胞株和持续低表达miR-142-3p的单克隆A549细胞株，饥饿培养过夜后用TGF-β1刺激6h，WesternBlot检测结果显示在TGF-β通路里miR-142-3p可以降低pSMAD3的表达。结论：NSCLC中miR-142-3p能够直接靶向TGFβR1的3’UTR种子序列。miR-142-3p高表达而TGFβR1基因低表达并且两者之间具有负相关性，miR-142-3p可能是一种癌基因，在肺癌的发生发展中，miR-142-3p参与TGF-β通路的传导，通过抑制TGFβR1基因的表达来抑制TGF-β通路下游分子pSMAD3的表达，进而破坏TGF-β通路的传导。通过研究miR-142-3p对TGFβR1基因的抑制作用可能会有助于提高我们对NSCLC的致病机制的了解，进而对NSCLC的诊断和治疗提供可靠的理论基础。
【作者】徐桂丽；
【导师】张洪涛；
【作者基本信息】苏州大学，遗传学，2014，硕士
【关键词】非小细胞肺癌；miR-142-3p；TGFβR1；表观遗传机制；p-SMAD3；

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