piggyBac转座系统的改造及其介导的牛核移植转基因供体细胞生产

【摘要】转座子(transposon)是一类能够在宿主基因组中跳跃移动的遗传因子，哺乳动物中具有活性的转座子很少。piggyBac(PB)转座子是一种能够在哺乳动物中高效转座的基因转移和功能基因筛选工具，有报道证实PB转座子不依赖宿主因子可在多种动物细胞中具有活性，且相对于线性化质粒和病毒载体，该系统更高效、更安全，因而在基因工程领域具有广阔应用前景。本研究通过对PB转座系统进行改造，利用其生产转基因牛成纤维和乳腺上皮细胞细胞，为体细胞核移植(SCNT)提供具有良好发育潜能的转基因核供体细胞，进而为以PB转座子介导的转基因动物的培育奠定基础。主要研究内容如下：1.通用型PB转座系统质粒的构建及基本元件的功能鉴定设计一个通用性PB转座载体供体质粒，除PB转座必需元件5’TR和3’TR外，其内部含包含一个由FMDV2A自剪肽介导的EGFP/Neo共表达的筛选报告标记，两端引入同向的两个loxP位点，一个拥有12个稀有酶切位点的多克隆位点(MCS)，和两个拷贝的CHS4鸡绝缘子核心序列，并以此为基础设计了三种PB转座系统，即传统二元质粒系统、单质粒系统和PB转座酶mRNA介导的转座系统。对上述功能元件和质粒进行鉴定，结果表明三种PB转座系统均构建成功。2.三种PB转座系统的转座功能和转座酶活性确认在HEK293细胞中对三种PB转座系统进行转座功能和转座酶活性确认。结果表明三种转座系统均可介导供体质粒中的PB转座元件特异性插入宿主基因组TTAA位点，转座功能正常。利用亚甲蓝染色确定细胞克隆数并统计转座效率，结果表明单质粒系统转座效率比二元质粒系统更高。转座酶活性检测试验证实，三种转座系统中PB转座酶mRNA生物安全性最高。3.PB转座酶的原核表达及其在HEK293细胞中的功能验证成功表达出N端含有TAT穿膜肽的PBase重组蛋白并将其转导进入HEK293细胞，利用免疫荧光技术观察该酶能否进入HEK293细胞核，并确认细胞克隆整合位点侧翼DNA序列检测，统计细胞克隆数。聚丙烯酰胺凝胶电泳和WesternBlotting鉴定结果表明PBase在大肠杆菌中成功表达，经分析发现其主要以可溶蛋白形式存在。免疫荧光结果表明N端融合TAT穿膜肽的PBase定位于细胞核，但是整合位点检测和转座效率统计结果表明原核表达的PBase蛋白在HEK293细胞中无法介导转座事件的发生。该转座系统能否在其他真核细胞中正常发挥作用，还需要进一步的研究。然而该研究依然为外源蛋白在TAT的介导下穿越真核细胞膜提供了一种可靠方法。4.PB转座子单质粒系统介导生产转基因牛成纤维细胞以PB转座单质粒系统为骨架，插入由牛β酪蛋白启动子介导的人溶菌酶(LYZ)和人乳铁蛋白(LTF)双基因乳腺特异性表达框，转染牛耳朵成纤维原代细胞进行细胞克隆筛选并对其进行相关检测，经鉴定的细胞克隆作为供体细胞利用体细胞核移植(SCNT)生产转基因克隆胚胎，并评价其体外发育状况。此外，在牛乳腺上皮细胞中对牛β酪蛋白启动子功能进行初步确认。结果显示PB转座单质粒系统可介导LYZ/LTF双基因表达框以转座的方式插入细胞基因组，筛选出3个单克隆细胞进行SCNT，结果表明转基因克隆胚胎体外发育状况良好。乳腺上皮细胞验证结果显示本研究使用的2.0kb长度β酪蛋白启动子功能正常。5.PB转座酶mRNA结合Cre-loxP系统生产无筛选报告基因牛乳腺上皮细胞以本研究构建的PB供体质粒pBNW-TP1为骨架载体，插入人LTF基因牛乳腺特异性表达框，与PB转座酶mRNA共转染牛乳腺原代上皮细胞(BMECs)，并筛选出稳定的转基因BMECs。原核表达、纯化His-NLS-TAT-Cre穿膜蛋白，利用转导的方式使其进入转基因BMECs用以移除细胞基因组中的筛选报告基因，用无筛选报告基因的BMECs生产转基因克隆胚胎并评价其体外发育状况。结果显示，PB转座酶mRNA系统可在BMECs中发生转座，利用His-NLS-TAT-Cre穿膜蛋白移除筛选报告基因后，LTF基因表达正常，且转基因克隆胚胎发育状况良好，表明用该方式生产的BMECs细胞是一种生物全能性和安全性较高的转基因细胞。在本研究中通过对PB转座系统的改造，可提高其转座效率和生物安全性，对筛选报告系统的改造使其更易指示和筛选阳性细胞。利用PB转座系统获得转基因生产转基因克隆胚胎并证实其体外发育状况良好，这为以PB转座系统生产较为理想的转基因动物或乳腺生物反应器奠定基础。
【作者】胡广东；
【导师】张涌；
【作者基本信息】西北农林科技大学，临床兽医学，2014，博士
【关键词】piggyBac(PB)；转座子；生物安全性；基因转移；人溶菌酶基因；人乳铁蛋白基因；体细胞核移植；Cre/loxP系统；无筛选报告标记；

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