斑蝥素对鳞翅目害虫生物活性及具生物活性衍生物合成研究

【摘要】东方粘虫Mythimnaseparata严重危害禾谷类粮食作物，其防治过程中对化学合成杀虫剂的过度依赖，造成了防治效果的严重下降。斑蝥素是芫菁科和拟步甲科昆虫产生的一种防御性化合物，对鳞翅目害虫有很好的防治效果，在中国已被开发成一种生物源杀虫剂。斑蝥素对粘虫的毒杀活性已有报道，然而亚致死剂量斑蝥素对粘虫种群参数的影响却未见报道。浸液法生物测定结果显示，斑蝥素乳油对粘虫幼虫有较高的毒性，96h时的LC50值为223μg/ml。我们检测了LC10亚致死剂量斑蝥素处理对粘虫种群参数的影响。结果显示，幼虫、蛹、成虫的存活率均下降；雌雄成虫翅畸形发育；周限增长率（λ），内禀增长率（r）及净升值率（R0）均显著降低；成虫生殖能力显著下降。亚致死剂量的斑蝥素通过降低粘虫的存活率和生殖力，延长粘虫的生命周期，从而阻碍了种群数量的增长。研究报道斑蝥素对棉铃虫Helicoverpaarmigera也有很好的毒杀作用。我们检测了亚致死剂量斑蝥素对棉铃虫细胞色素P450的影响。结果显示，P450活性在处理后12h到48h均显著升高。我们进一步检测了斑蝥素处理后CYP6B7在转录水平的变化。半定量RT-PCR结果显示，亚致死剂量斑蝥素处理后12h，24h，36h和48h时，CYP6B7的表达量分别为对照组的1.01倍，1.23倍，1.68倍和1.62倍。我们推测棉铃虫体内CYP6B7和其他P450基因的过表达可能会参与对斑蝥素的抗性。前期研究发现斑蝥素对棉铃虫碱性磷酸酶（H.a-ALP）有抑制活性，而且影响其转录水平。然而，由于没有合适的检测体系，尚无关于斑蝥素及其他抑制剂处理后棉铃虫碱性磷酸酶蛋白水平的变化的报道。基于抗体的检测手段可以准确测定鳞翅目害虫的碱性磷酸酶蛋白水平。为建立此抗体测定体系，我们克隆并表达了棉铃虫的碱性磷酸酶基因（GenBank登录号：EU729322）。将通过PCR获得的1608bp开放阅读框连接到pET-32a原核表达载体构建了重组表达质粒，转化到原核表达菌株BL21(DE3)获得了重组蛋白。纯化后的重组蛋白注射新西兰大白兔，利用ELISA法检测血清中抗体的效价，最终获得了棉铃虫碱性磷酸酶的多克隆抗体。Westernblot检测发现，此抗体不仅对棉铃虫碱性磷酸酶有很好的结合活性，而且也能特异性的结合粘虫和小菜蛾的碱性磷酸酶。利用此抗体我们也检测了棉铃虫不同龄期碱性磷酸酶蛋白水平的变化。我们认为，基于棉铃虫碱性磷酸酶抗体的蛋白水平检测可以更有效地检验此基因的特异性表达。另外，此抗体可用于检测棉铃虫碱性磷酸酶的组织分布和蛋白表达水平，以及用于研究可能涉及棉铃虫碱性磷酸酶的相关研究。斑蝥素是一种具有较好杀虫活性、结构新颖的天然化合物。斑蝥素已被证明是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的抑制剂。斑蝥素作用方式新颖，具有潜在应用价值，然而目前无法实现斑蝥素的大量提取或者化学合成。斑蝥素类似物合成较易，而且具有良好的生物活性。本实验中，以去甲斑蝥素为先导化合物，用乙醇和氯代乙醇取代其结构中的酸酐环部分，分别获得了一取代去甲斑蝥酸乙酯和一取代去甲斑蝥酸-2-氯乙酯。后续实验将对这两类斑蝥素衍生物的杀虫活性进行鉴定。
【作者】MaryamRashid；
【导师】张雅林；
【作者基本信息】西北农林科技大学，农业昆虫与害虫防治，2014，博士
【关键词】斑蝥素；粘虫；棉铃虫；CYP6B7；衍生物；

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