Chk1和p53在肿瘤细胞S期DNA损伤检查点中的复杂关系研究

【摘要】Chkl激酶是哺乳动物细胞周期中S期DNA损伤检查点的主要调控蛋白,能够因DNA链的断裂而激活,进而对磷酸脂酶Cdc25A等周期调控蛋白进行磷酸化,使其通过泛肽-蛋白酶途径降解,导致细胞周期进程的停滞。P53是肿瘤抑制因子,已有的研究揭示,它在S期DNA损伤检查点的活动过程中也发挥着重要的作用。但是,目前并不是很清楚Chkl和p53二者在这个过程中是如何进行分工和协调?在本项研究中,我们对Chkl和p53在S期DNA损伤检查点的作用关系进行了深入的探讨。我们选择了HeLa细胞作为研究体系。HeLa细胞感染了HPV18病毒,而病毒的E6蛋白能够与p53结合并导致p53的降解,使HeLa细胞的p53通路不能被正常激活。我们使用E6siRNA对HeLa细胞的HPV18E6基因进行抑制,使得p53的表达水平和功能得到了很好的恢复。同时我们将E6siRNA技术与细胞同步化相结合,得到了S期p53功能恢复的HeLa细胞,为后续的研究奠定了基础。我们的研究结果显示,在用DNA损伤药物MMS处理的S期HeLa细胞中,如果用Chkl抑制剂UCN-01抑制了Chkl的磷酸化,在p53功能缺失的情况下将上调G2/M期的关键周期蛋白cyclinBl表达,进而导致相当比例的异常有丝分裂期细胞的出现。但是,在18E6siRNA转染而恢复了p53功能的S期HeLa细胞中,同样的处理条件下,cyclinBl蛋白水平的上调被抑制,说明p53阻止了DNA损伤的S期HeLa细胞由于Chkl的失活而导致的周期蛋白CvclinBl的重新积累。同时,在Chkl失活情况下,恢复功能的p53抑制了MMS阻滞的Hela细胞中异常有丝分裂期比例的增加,但是却提高了凋亡比例,说明在DNA损伤所致的S期阻滞细胞中,当Chkl的功能被抑制时,p53可以在S期DNA损伤检查点中起到协助作用,通过诱导凋亡的方式以阻止细胞进入异常的有丝分裂。然而,恢复了p53功能的S期HeLa细胞,在MMS单独处理使得Chkl激活的条件下却没有发生caspase-3的激活,也没有出现明显的细胞凋亡。如果在这些MMS处理的细胞中同时采用UCN-O1抑制Chkl的活性,将导致caspase-3的激活,并形成明显的细胞凋亡。有趣的是,MMS的处理会导致p53功能恢复的HeLa细胞的凋亡因子Bax的基因表达水平和蛋白质水平的显著上调,并且这种上调不依赖于Chkl的活性。这些结果说明激活的Chk1能够抑制p53诱导的caspase-3依赖的细胞凋亡过程,但是并没有抑制p53介导的Bax的上调。进一步研究结果显示,在p53功能恢复的HeLa细胞中,在MMS单独处理使得Chkl激活的条件下Bcl-2蛋白水平没有明显的下调,而且抗凋亡因子XIAP的蛋白水平出现明显的上调；同时细胞色素c从线粒体中的释放则受到了明显的抑制。这些结果说明,激活的Chkl通过维持Bcl-2和XIAP这两个抗凋亡蛋白的高水平而抑制了MMS损伤下p53诱导的Bax促凋亡效应以及caspase-3的激活,从而阻止了细胞凋亡的发生。综上所述,我们的工作揭示了Chkl激酶和p53在肿瘤细胞周期DNA损伤检查点中应对DNA损伤反应中的复杂关系。无论是在p53功能缺失还是p53功能被恢复的HeLa细胞中,Chk1激酶都是负责S期DNA损伤检查点工作的重要检查点蛋白。在DNA损伤发生时,Chkl可以通过诱导细胞周期阻滞来阻止异常有丝分裂,同时通过抑制p53诱导的细胞凋亡来维持细胞的活力。一旦Chkl的活性被抑制,激活的p53可以起到协助的作用,通过诱导caspase-3依赖的细胞凋亡过程以防止细胞进行异常的有丝分裂。这些研究为发展治疗肿瘤的药物研发和防治策略提供了新的思路。
【作者】马晓宇；
【导师】吴家睿；
【作者基本信息】中国科学技术大学，生物化学与分子生物学，2012，博士
【关键词】细胞周期；DNA；损伤检查点；p53；HPV18病毒；甲磺酸甲酯；Chk1；UCN-01；

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