肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡在重症急性胰腺炎肺损伤发病机制中的作用及清胰汤干预的实验研究

【摘要】目的：重症急性胰腺炎（severeacutepancreatitis，SAP）发病凶险，死亡率极高，早期即会并发器官衰竭。急性肺损伤（acutelunginjury，ALI）是导致重症急性胰腺炎患者早期高死亡率的主要原因，可以引起全身炎症反应，甚至导致急性呼吸窘迫综合症（acuterespiratorydistresssyndrome，ARDS）而引起患者死亡。急性肺损伤在病理学上的表现为弥漫性肺微血管内皮损伤、肺泡上皮损伤、炎症细胞（中性粒细胞、巨噬细胞等）的浸润、肺出血、肺水肿等。细胞凋亡作为细胞生存与死亡的平衡点，在急性肺损伤的发病过程中发挥重要的作用。一方面急性肺损伤时中性粒细胞的大量凋亡可防止其过度释放炎性因子，从而保护肺组织；另一方面，细胞凋亡途径可同时诱导肺泡上皮细胞及肺微血管内皮细胞的凋亡，引起肺泡壁结构完整性的破坏，从而加重肺损伤的程度。肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolartypeIIepithelialcell，AECⅡ）是肺泡上皮的原始干细胞，不仅可以补充和分化成肺泡I型上皮细胞（alveolartypeIepithelialcell，AECI），起到修复肺组织损伤的作用，还可以合成、分泌肺表面活性物质，维持肺泡的稳定性，保持肺泡表面水电解质的平衡，参与机体的免疫调节。在正常的肺组织中，肺泡上皮细胞可以通过自我更新，修复它正常的凋亡；而在急性肺损伤时，肺泡Ⅱ型上皮细胞成为最主要的损伤靶细胞其分化和凋亡都将受到影响。目前，关于肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的研究，主要涉及到三条经典细胞凋亡途径（死亡受体途径、线粒体途径、内质网途径），三条经典细胞凋亡途径之间既相互独立又相互联系。Fas触发的死亡受体凋亡机制与早期细胞内Ca2+浓度的升高密切相关。钙离子作为细胞内重要的第二信使，其超载可能在线粒体介导的细胞凋亡途径中发挥重要作用。内质网是Ca2+的主要储存库，它的稳态失衡可以活化Caspase-3而诱导细胞凋亡。膜片钳技术(patch-clamptechnique)是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术，目前被认为是研究离子通道的“金标准”，已成为研究离子通道的最重要的技术。该技术可以直接分辨出单个离子通道的电流，从而观察该离子通道的开放和关闭的过程，用于检测细胞内钙离子浓度的变化与影响。本研究通过制备SAP肺损伤大鼠模型，探究SAP相关性肺损伤的发病机理，研究在急性胰腺炎肺损伤时中药清胰汤（Qingyitang）、钙通道阻滞剂硝苯地平（Nifedipine）、抗炎药物地塞米松（Dexamethasone）对肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡及凋亡相关基因的表达、细胞内游离Ca2+的浓度、以及对炎性细胞因子表达水平的影响；利用膜片钳技术观察硝苯地平对脂多糖（LPS）处理的A549细胞钙离子通道的电流影响。本研究将探究肺泡Ⅱ型上皮细胞内游离Ca2+的超载与肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的相关性、肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡参与重症急性胰腺炎肺损伤的发病机理、探讨中药清胰汤对重症急性胰腺炎相关性肺损伤保护作用及机理，为临床上应用中西医结合方法有效提高重症急性胰腺炎及其肺损伤的治疗效果提供理论指导和实验依据。方法：健康雄性SPF级SD大鼠，采用经十二指肠乳头内侧胰胆管处注入15g/L脱氧胆酸钠（sodiumdeoxycholate）的方法制备SAP大鼠模型。60只SD大鼠随机分为5组：模型组（Severeacutepancreatitis，SAP组）为脱氧胆酸钠胰胆管注射组；假手术组（Sham-operation，SHAM组）为打开腹腔后，仅轻轻翻动胰腺；清胰汤治疗组（QingYiTang，QYT组）、硝苯地平药物处理组(Nifedipine,NIF组)和地塞米松处理组（Dexamethasone，DEX组）则在实验大鼠造模之后给予相关的灌胃治疗或尾静脉药物注射处理。实验动物均于造模后24h用10%水合氯醛麻醉，留取血液和组织标本，分离、提取肺泡Ⅱ型上皮细胞，应用流式细胞仪（flowcytometry，FCM）检测肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡比例，用激光扫描共聚焦显微镜检测肺泡Ⅱ型上皮细胞内的游离Ca2+浓度；RT-PCR检测肺泡Ⅱ型上皮细胞Caspase-8及Bax凋亡基因的转录水平；用免疫组织化学方法检测肺组织Caspase-8及Bax蛋白的表达情况；采用蛋白印迹（Westernblot）法检测肺组织Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白的表达情况；使用透射电镜鉴定肺泡Ⅱ型上皮细胞并观察细胞中线粒体超微结构的改变；肺组织和胰腺组织进行病理学切片、染色；用ABC-双抗体夹心法（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）测定大鼠血清TNF-α的浓度；使用真空干燥法测量肺组织湿/干比值；采用全自动生化分析仪检测大鼠血清淀粉酶的浓度并进行血气分析。应用膜片钳技术对不同浓度脂多糖（LPS）和硝苯地平处理的A549单个细胞进行全细胞模式检测，记录硝苯地平对Ca2+通道电流的影响。结果：(1)与SHAM组相比，肺组织病理学检测结果显示模型组符合SAP相关性肺损伤的特征（SHAM组病理结果显示无异常）；模型组肺组织湿/干比值显著升高（P<0.01）；模型组动脉PaO2显著下降（P<0.01）；模型组动脉PaCO2明显上升（P<0.01）；模型组实验大鼠血清TNF-α和淀粉酶（amylase，AMY）含量显著升高（P<0.01）；透射电镜观察模型组肺泡Ⅱ型上皮细胞内线粒体的形态破坏严重，线粒体双层膜结构模糊，线粒体肿胀、脊大量断裂；FCM检测模型组AECII凋亡率显著上升（P<0.01）；激光扫描共聚焦显微镜检测模型组AECII内游离的Ca2+浓度显著增大（P<0.01）；反转录酶-聚合酶链锁反应检测模型组AECII中Caspase-8及BaxmRNA表达显著增多（P<0.01）；免疫组织化学法检测模型组肺组织Caspase-8及Bax蛋白表达均显著增多（P<0.01）；蛋白印迹（Westernblot）法检测模型组肺组织Bax、Caspase-3、Caspase-9相关凋亡蛋白表达显著增加（P<0.01），而在其它三个药物治疗组中各项检测指标与SAP型组相比都有不同程度的降低，但与SHAM组相比各种检测指标均有不同程度的增高；蛋白印迹（Westernblot）法检测模型组肺组织Bcl-2蛋白表达明显下降（P<0.01），而在其它三个药物治疗组中Bcl-2蛋白表达与SAP型组相比均有不同程度的升高，但与SHAM组相比Bcl-2蛋白表达有不同程度的下降。（2）全细胞膜片钳记录结果表明：5μg/mL的LPS与对照组峰值电流比较无显著变化（n=10，P﹥0.05）；10μg/mL的LPS与对照组峰值电流比较有显著变化，峰值电流增大（n=10，P<0.05）；15μg/mL的LPS与对照组峰值电流比较有显著变化，峰值电流减小（n=10，P<0.05）；硝苯地平对10μg/mlLPS处理的A549细胞钙电流90%被阻断，也进一步证明了此电流为钙离子电流，并且对LPS刺激后的A549钙电流有阻断作用。结论：(1)重症急性胰腺炎时，AECII的过度凋亡直接参与SAP相关性ALI中肺组织的损害，且二者呈正相关关系。(2)在重症急性胰腺炎相关性急性肺损伤时，血清中TNF-α含量显著升高，且与AECⅡ的凋亡指数呈正相关。(3)研究显示肺泡Ⅱ型上皮细胞内Ca2+的超载可促进肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡。(4)SAP相关性急性肺损伤时，肺泡Ⅱ型上皮细胞Caspase-8及Bax凋亡基因mRNA表达增多，且Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9相关凋亡蛋白表达显著增加而肺组织Bcl-2蛋白表达显著下降，由此死亡受体以及线粒体两条凋亡途径可能均在AECII的凋亡过程中扮演着重要的角色。(5)应用中药清胰汤、钙离子拮抗剂硝苯地平、抗炎药地塞米松可以明显保护肺组织，抑制血清TNF-α的分泌、降低AECII的凋亡比例以及下调Caspase-8及BaxmRNA的表达，抑制肺组织Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9相关凋亡蛋白的表达，促进Bcl-2蛋白的表达。(6)当前临床使用的单纯西药治疗存在着作用单一、价格昂贵、药物副作用等缺点，而使在SAP时的应用受到一定限制；随着对SAP时肺损伤发病机制认识的不断深入，中西医结合治疗可能成为防治SAP及其相关肺损伤的重要手段。(7)膜片钳技术离子通道电流检测可以直接反应不同药物处理后细胞离子通道通透性改变，对于揭示细胞电生理机制具有良好的应用价值。
【作者】刘哥良；
【导师】陈海龙；
【作者基本信息】大连医科大学，中西医结合临床，2014，博士
【关键词】钙离子；肺泡Ⅱ型上皮细胞；重症急性胰腺炎；急性肺损伤；清胰汤；

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