NK细胞活化性受体NKp30的配体鉴定与功能研究

【摘要】自然杀伤细胞(naturalkillercells,NK)是天然免疫系统中重要的效应淋巴细胞,在肿瘤免疫监视方面发挥关键作用。NK细胞快速杀伤靶细胞无需预先免疫,也没有MHC限制性,NK细胞的活性依赖其表面组成性表达的抑制性和活化性受体信号的平衡。自然杀伤性受体(naturalcytotoxicityreceptors,NCRs)是NK细胞重要的活化性受体,其成员之一NKp30表达在所有人NK细胞表面,在NK细胞对抗病毒感染细胞和肿瘤细胞中扮演重要角色。Galectin-3(简称Gal-3)是p半乳糖苷结合蛋白家族成员之一,其包含两个碳水化合物结合区域,有较强的p半乳糖亲合力,能够被多种形式的肿瘤细胞表达。据报道,它可以直接作为免疫调节剂去诱导活化的T细胞的凋亡。尽管如此,它对NK细胞的影响还是不十分清楚,为此,构建和筛选了高效表达人NKp30胞外段和人IgGFc段嵌合蛋白的CHO细胞株,并由此获得有生物活性的可溶性NKp30-Fc蛋白。进一步使用人宫颈癌细胞系,以及宫颈腺癌异种移植的非肥胖性糖尿病和重症联合免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠模型对Gal-3分子在NKp30介导的NK细胞抗肿瘤效应中的作用进行研究。主要取得了以下结果：1,重组人NK细胞活化性受体NKp30融合蛋白的制备和功能鉴定。我们构建了NKp30受体胞外段融合了人IgGl的Fc段(NKp30-Fc)的表达载体,利用脂质体转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)的方法进行真核表达,通过G418抗生素加压筛选成功获得表达NKp30-Fc蛋白的细胞克隆,进一步通过有限稀释法获得高表达NKp30-Fc蛋白的细胞亚克隆。接下来我们采用ELISA方法筛选高分泌可溶性NKp30-Fc蛋白的亚克隆细胞,并收集其细胞无血清培养上清,使用亲和层析法进行可溶性NKp30-Fc蛋白的纯化.通过Westernblotting方法进行纯化后鉴定,最终,我们获得的NKp30-Fc蛋白的纯度在90%以上。功能方面,我们通过流式细胞术发现可溶性NKp30-Fc蛋白能够结合NKp30配体阳性的肿瘤细胞,此外,51Cr同位素释放实验也证明了NKp30-Fc蛋白作为拮抗剂能够削弱NKp30介导的人NK细胞抗肿瘤效应。2,肿瘤细胞分泌的Gal-3作为人NKp30的可溶性抑制配体,在肿瘤逃逸NK细胞攻击中起重要作用。我们使用重组的人NK细胞活化性受体NKp30融合蛋白(NKp30-Fc)和人宫颈癌模型,发现可溶性NKp30-Fc能够免疫沉淀肿瘤细胞来源的Gal-3蛋白,NKp30和Gal-3的相互作用通过表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance简称SPR)实验被进一步证明。我们的研究发现Gal-3以一种可溶形式被肿瘤细胞分泌,流式细胞术证明了可溶的Gal-3能够特异的结合NK细胞,进一步生物化学方法也证明了可溶的Gal-3能够结合NK细胞表面的NKp30分子。功能方面,当Gal-3被加入到NK-92与Hela细胞的共孵育系统时,我们发现NKp30介导的,而非NKG2D介导的,NK细胞表达CD107a能力和其细胞毒活性被抑制。若将可溶的Gal-3和NKp30-Fc蛋白预先孵育,这个抑制效应则被恢复。此外,51Cr同位素释放实验显示,若Gal-3表达被下调(shGal-3),将增强Hela细胞对NK细胞杀伤的敏感性,相反,Gal-3过表达(exGal-3)的Hela细胞对于NK细胞的杀伤将变得不敏感。这些体外的实验结果在shGal-3-HeLa或exGal-3-HeLa异种移植的,NK细胞过继免疫治疗后(?)NOD-SCID鼠模型中被进一步证明,表明了体内Gal-3能够强烈对抗人NK细胞抗肿瘤效应。终上所述：通过这里描述的方法制备的重组NKp30-Fc分子有足够的能力结合NKp30配体阳性的肿瘤细胞,能够与NKp30受体的天然,膜结合形式竞争。这个工具分子在定义NKp30与其配体的相互作用中具有广泛应用,同时有助于寻找NKp30受体功能的拮抗剂。此外,我们证明了肿瘤细胞分泌的Gal-3作为NK细胞活化性受体NKp30的可溶抑制性配体,能够抑制NK细胞抗肿瘤效应。此项研究提出了Gal-3能够调节NK细胞抗肿瘤免疫的新机制,或许能为肿瘤治疗提供新的治疗靶点。
【作者】王微；
【导师】孙汭；
【作者基本信息】中国科学技术大学，细胞生物学，2014，博士
【关键词】NK细胞；NKp30；NKp30-Fc；Galectin-3；细胞杀伤；肿瘤逃逸；

【参考文献】
[1]张勇.空间站AOS方案研究[D].西北工业大学,导航、制导与控制,2004,硕士.
[2]赵珍.视频会议中缓冲队列的设计与实现[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[3]任之馗.郑州枢纽郑州站西出口工程施工过程风险控制研究[D].西南交通大学,项目管理,2013,硕士.
[4]江岑.广播电视编辑胜任力模型建构[D].扬州大学,应用心理学,2011,硕士.
[5]李鲲.基于H.323协议的省地税局视频会议系统设计与实现[D].南昌大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[6]张建华.刍议电信企业资源优化配置[J].通信世界,2003,19:30-31.
[7]童杨柳.《紫色》中黑人男性形象的妇女主义解读[D].安徽大学,英语语言文学,2013,硕士.
[8]王彬鑫.青虾产业链竞争力及其影响因素研究[D].南京农业大学,企业管理,2011,硕士.
[9]吴敌.论刑法中的被害人承诺[D].河北经贸大学,刑法学,2012,硕士.
[10]贾小杨.非英语专业学生听力焦虑，听力策略与听力水平的相关性研究[D].河北师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[11]张博.论危险驾驶罪的宽与严[D].吉林大学,法律,2014,硕士.
[12]史传明.MIP技术在催化裂化装置应用研究[D].东北石油大学,化学工程（专业学位）,2013,硕士.
[13]张汉嘉.再论渔政管理在渔业中的地位和作用[J].现代渔业信息.1992(12)
[14]张朱李.网络公证的证明效力探析[D].华中科技大学,法律,2013,硕士.
[15]谢雅婷.RFID电子标签管理系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[16]王双义.肉毒杆菌素对兔颞下颌关节骨关节病治疗作用的研究[D].青岛大学,口腔临床医学,2003,硕士.
[17]于静静,王磊,刘全俊.纳米孔单分子分析技术研究进展[J].材料导报,2015,05:110-115.
[18]杨港.论外语学习者文化意识的培养[D].曲阜师范大学,外国语言学及应用语言学,2004,硕士.
[19]朱晓梅.多元智能化主题探究活动中幼儿学习评价的研究[D].华中师范大学,教育管理,2012,硕士.
[20]李作宽.合理选择示波器[J].宇航计测技术.2000(03)
[21]包晨露.石墨烯及其典型聚合物纳米复合材料的制备方法、结构与机理研究[D].中国科学技术大学,2012.
[22]赵青秀.民众内约束力影响因素研究[D].南昌大学,应用心理学,2012,硕士.
[23]乔信江.教学培训信息管理系统的分析与设计[D].云南大学,软件工程,2012,硕士.
[24]何婧.基于心理契约的幼儿教师激励研究[D].华东师范大学,学前教育学,2013,硕士.
[25]杨敏龙.基于RBF神经网络的多核设计空间探索预测模型[D].武汉理工大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[26]陈万里.基于商空间理论和粗糙集理论的粒计算模型研究[D].安徽大学,2005.
[27]刘婧,凌晨晗,赵冬冬,周景义,赵学群,张建民.Halsted缝合法在腰大池置管引流术中的应用[J].浙江创伤外科,2014,03:368-369.
[28]刘德华.不确定条件下综合快捷货运服务网络运输能力计算研究[D].大连海事大学,物流工程与管理,2013,硕士.
[29]张国胜.铁路运输企业的技术创新[J].中国铁路.1999(11)
[30]高双菊.异颖草属及其近缘属的系统学研究[D].山东师范大学,植物学,2013,硕士.
[31]宋增.林业建设是黄淮海平原农业开发治理的先导和后盾[J].河北林业科技.1989(04)
[32]姜洋.抗阻训练对衰老小鼠肝脏AMPK/SIRT1/NF-kB信号通路介导的炎症反应的影响[D].华东师范大学,运动人体科学,2013,硕士.
[33]王旭芳.蒙古语主语信息数据库的构建[D].内蒙古大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[34]张伟.统一潮流控制器（UPFC）的控制方法研究[D].湖南大学,电力电子与电力传动,2003,硕士.
[35]牛海港.SBS/废橡胶粉复合改性高性能路用沥青材料的研制[D].湖南大学,高分子化学与物理,2011,硕士.
[36]海欣.教育信息资源利用效益提升研究[D].华中师范大学,教育技术学,2014,硕士.
[37]郭琦,赵晋泉,张伯明.基于变参数追踪的暂态稳定分析与预防控制方法[J].电力系统自动化,2005,24:21-26+49.
[38]李晓宾.民办高校教学津贴管理系统的设计与实现[D].南昌大学,计算机技术（专业学位）,2012,硕士.
[39]刘洪林,杨微,王江,陈可洋.地层切片技术应用的局限性——以海拉尔盆地贝尔凹陷砂体识别为例[J].石油地球物理勘探,2009,S1:125-129+168+2.
[40]张志兵.空间数据挖掘关键技术研究[D].华中科技大学,2004.
[41]冯振杰.La_（2-x）Sr_xMnO_4的结构、物性及电荷有序研究和新超导体Na_xCoO_2·yH_2O的电化学合成[D].辽宁工程技术大学,材料加工工程,2004,硕士.
[42]潘晓晨.图像压缩感知融合恢复算法研究[D].大连海事大学,信息与通信工程,2013,硕士.
[43]赵君钦.红外警戒系统中行人检测与识别技术研究[D].国防科学技术大学,信息与通信工程,2012,硕士.
[44]赖夏颉.基于数据挖掘技术的厌氧消化系统模拟研究[D].西南交通大学,环境工程,2014,硕士.
[45]刘铖.可编程序调节器在流化床控制系统上的应用[J].冶金自动化,2001,02:11.
[46]高秀娟.基于粗糙集和贝叶斯网络的入侵检测算法研究[D].北方民族大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[47]陈柱.流动QCM全自动DNA分析系统的研制[D].湖南工业大学,生物医学工程,2012,硕士.
[48]孙瑞.人工骨膜修复兔桡骨大段骨缺损的实验研究[D].兰州大学,外科学,2013,硕士.
[49]白洋.吉林省高等职业院校学生就业形势的分析研究[D].吉林大学,思想政治教育,2012,硕士.
[50]江丽红.miR-365在UVB诱导细胞损伤中的作用及其与p53关系的初步研究[D].南方医科大学,放射医学,2012,硕士.