人ECT2蛋白N端结构域的晶体结构以及RNA核磁方法的研究

【摘要】1.ECT2串联BRCT结构域的结构与功能ECT2是一个人源的调控蛋白,它在细胞周期调控中扮演着重要的角色。ECT2是由N端的三个串联BRCT结构域和C端的DH-PH结构域组成。N端和C端的结构域之间有相互作用,并且能够形成一种自抑制的状态。在有丝分裂后期,CYK-4与ECT2之间形成相互作用,并解除ECT2的自抑制状态,CYK-4的4个磷酸化位点在相互作用中起着非常关键的作用。在中心纺锤体,被释放的DH-PH结构域能够增强RhoAGTP酶的活性,促进分裂沟的形成。然而仍然有很多有趣的问题没有解决,比如CYK-4与ECT2之间的结合在分子水平上究竟是如何作用的,另外4个磷酸化丝氨酸中哪个或哪几个在其中扮演着最重要的作用也是亟待研究的问题。为了回答这些问题,在我们的研究中,我们采用晶体衍射的方法,解析了ECT2N端3个串联BRCT结构域的结构,同时通过与其他的BRCT结构域之间的比较,发现了一些有趣的特性。另外,我们深入研究了ECT2和CYK-4之间的相互作用,确定了4个磷酸化位点中的一个,pS164,作为主要的结合位点,与ECT2的第二个BRCT结构域上的经典结合口袋结合。荧光检测的酶活实验证实了CYK-4通过结合ECT2串联BRCT结构域并解除自抑制能够恢复RhoAGTP酶的酶活。最后关于ECT2与CYK-4之间结合特性的讨论解释了弱结合的成因并分析其在细胞周期调控中的重要生理意义。2.基于核磁方法的RNA结构的初步研究随着对RNA研究的不断深入,人们逐渐发现RNA不仅能够作为信息载体(mRNA)、结构元件(ribosome)以及生物催化剂(ribozyme)等发挥功能,还能够作为分子开关(riboswitch)调节细胞表达,作为细胞中的调控分子(siRNA、miRNA)通过识别和配对,对mRNA的稳定性和翻译进行调控。sRNA或UTR区域的RNA都可以参与基因表达调控。但是在结构生物学领域,RNA的结构测定与蛋白质相比不仅在数量上只处于起步阶段,而且在方法上也还没有成熟。我们首先对RNA的转录纯化方法进行了摸索,并在实验室建立了一套比较完整的转录纯化体系,然后对RNA的核磁方法研究进行了探索,完成了一系列RNA偏好的脉冲序列的设定,并对相应参数进行了优化。非编码RNA(ncRNA)主要以RNA形式发挥功能,根据分子长度可以简单地划分为sncRNA和lncRNA两种。DsrA是大肠杆菌中的一种sRNA,它能够与蛋白编码基因rpoS的5’UTR结合,使其核糖体结合区SD序列暴露出来从而激活rpoS基因的转录和表达,这个过程需要一种Sm蛋白Hfq的协助。我们首先尝试用核磁方法对DsrA进行研究,通过实验我们发现DsrA三个茎环结构中只有第一个的结构比较稳定,也是与Hfq联系最密切的区域,而后面序列的结构都不够稳定。随后的荧光偏振实验又进一步证实了Hfq不仅是DsrA的分子伴侣,它在DsrA与rpoS的相互作用过程中可能也起到了至关重要的作用。近期中山大学宋尔卫教授发现的lncRNAuc002xyu能够通过与NF-κB结合阻止IκB的磷酸化从而导致其不能从NF-κB上解离下来。我们通过EMSA实验证实uc002xyu能够通过一段短的RNA螺旋结构与NF-κB的p65亚基特异性的结合,而抑制IκB磷酸化的机制可能与lncRNA其他部分有关。
【作者】邹杨；
【导师】施蕴渝；吴季辉；
【作者基本信息】中国科学技术大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】结构域；RNA；ECT2；晶体结构；细胞周期调控；中心纺锤体；宋尔卫；结构生物学；荧光偏振；亚氨基；

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