铜绿微囊藻气囊蛋白GvpF的结构与功能研究

【摘要】铜绿微囊藻MicrocystisaeruginosaPCC7806是一种单细胞的浮游蓝藻,它可在淡水水体表面季节性聚集暴发水华。例如,我国的太湖和巢湖近年常暴发蓝藻水华,而铜绿微囊藻就是形成水华的最优势藻种。铜绿微囊藻细胞内能大量产生一种亚细胞器,叫做气囊。气囊是一种中空、充满气体的惰性结构,它完全仅由蛋白质组成。气囊的作用就是可以通过降低藻细胞的密度为其提供浮力,这样蓝藻可以自行调节在自然水体中的垂直位置,它们可以漂浮到水体中氧气和光照都适宜的位置以利于自身的生长和后续的生境殖民化。所以气囊的存在是铜绿微囊藻能成为优势藻种的重要原因之一。研究气囊的特性对治理蓝藻水华暴发有一定的理论指导意义。目前研究已证实气囊的合成涉及8-14个不同的气囊蛋白Gvp(gasvesicleproteins),这些Gvp蛋白是由gvp基因簇编码的,而gvp基因簇被发现广泛存在于产气囊的细菌和古细菌中。现已鉴定铜绿微囊藻M.aeruginosaPCC7806气囊合成基因簇大小是8.7kb,包含有12个gvp基因。其中的10个基因分别组成两个操纵子,它们是gvpAⅠAⅡAⅢCNJX和gvpKFG。剩下的两个基因gvpV和gvpW是独自表达的。GvpA和GvpC被广泛研究,它们是气囊的主要结构组成蛋白。分子量较小(7-8kDa)且疏水很强的蛋白GvpA构成气囊壁上的棱纹结构,它是气囊的最主要结构蛋白。而分子量较大的、较亲水的次要结构组分蛋白GvpC则是位于气囊壁的最外表面,通过与GvpA相互作用来稳定气囊的结构。除了gvpA和gvpC编码的两个蛋白GvpA和GvpC是气囊的结构组成蛋白外,蓝藻中其它的gvp基因和Gvp蛋白也可能涉及参与气囊的合成。本研究中,我们通过单波长散射法解析了铜绿微囊藻M.aeruginosaPCC7806中气囊基因gvpF编码的气囊蛋白GvpF的晶体结构,分辨率是2.7A。这是第一个被解析的气囊蛋白的三维立体结构。分析GvpF的三维结构可得知,GvpF是由结构上完全不同的两个结构域组成,分别命名为N端结构域和C端结构域。这两个结构域的整体折叠类型都属于α+β家族。其中,将N端结构域的结构与α+β家族的其它蛋白结构进行比较,可看出N端结构域的结构折叠模式与其它蛋白都不一样,它采取的是一个新的折叠方式。而C端结构域含有一个改变了的铁氧还蛋白折叠的结构类型,与正常的铁氧还蛋白折叠的结构相比,C端结构域一个明显的变化就是多了一个由三股连续螺旋构成的一个延伸结构。N端结构域和C端结构域彼此相对排列,GvpF的C末端的“尾巴”结构通过分别与N、C端结构域相互作用来稳定GvpF的整体结构。同时,我们将GvpF的整体结构做Dali搜索,与PDB中的其它结构做结构比对,并没有发现同源结构。由这几个方面,我们认为GvpF的三维结构是一个新颖的结构。同时,我们纯化出铜绿微囊藻M.aeruginosaPCC7806的气囊,负染电镜观察气囊的结构均呈现圆柱体状。气囊的直径都是相似的,大概120nm,长度从500nm到1500nm不等。气囊壁的外表面也可以观察到等距相间排列的棱纹结构。SDS-PAGE凝胶电泳和质谱都只检测到纯化的气囊中的结构蛋白GvpC的存在。而蛋白质印迹法和免疫胶体金实验以及基于免疫胶体金的断层成像技术均证明GvpF是气囊的一个结构组成蛋白,而且是定位在气囊壁的内表面即朝向气体的一面。为了获取其它Gvp蛋白的结构和功能信息,我们也一一表达纯化了其它Gvp蛋白。除了GvpA是包涵体表达外,其它Gvp蛋白均有上清表达。通过纯化结晶摸索,我们获得了GvpC和GvpW的晶体,但是GvpC晶体不衍射且不易重复,而GvpW晶体的衍射只有十几埃,晶体优化还在进行。同时我们也初步证明了GvpN是一个ATPase酶。我们还在努力希望能获得这些Gvp蛋白的晶体,通过解析它们的三维结构,结合结构来探索验证它们的功能。
【作者】许柏英；
【导师】周丛照；陈宇星；
【作者基本信息】中国科学技术大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】铜绿微囊藻；气囊；Gvp蛋白；GvpF；晶体结构；结构蛋白；

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