TFF1和TFF3在结直肠癌转移中的作用及与上皮间质转化的关系研究

【摘要】结直肠癌是消化道系统常见的恶性肿瘤之一,我国大肠癌发病率位于恶性肿瘤的第三位,死亡率位于恶性肿瘤死亡率的第五位,在欧美等西方国家占恶性肿瘤死因的第二位。近几十年来,随着人民生活水平的提高及饮食结构的变化,大肠癌的发病率、死亡率逐年增高,且有年轻化趋势。根治性治疗后异时性转移,特别是肝转移是预后不良的主要原因。约35%结直肠癌确诊即伴有肝转移,同时性肝转移率为15-25%,异时性肝转移率40-50%。尸检甚至高达60%～70%。筛选高危患者及有效的肿瘤标记物是改善预后的重要环节。三叶因子(trefoilfactorTFF)家族具有一个或多个三叶因子结构域的多肽小分子,主要由消化道黏液分泌上皮细胞合成和分泌,在粘膜损伤修复过程中起主要作用。TFF家族有三个成员：TFF1(乳腺癌相关肽,pS2)、TFF2(解痉多肽,SP)和TFF3(肠三叶因子,ITF)。TFF在整个消化系统中均有表达分布,胃肠道是TFF的主要合成场所。TFF1和TFF2在胃部,TFF3则主要在大肠和小肠呈高表达。近年来TFF家族与肿瘤发生,侵袭及临床预后等方面的相关性广受关注。近来研究表明TFF1在乳腺癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌等许多肿瘤和转移灶中表达,与肿瘤细胞增殖、凋亡、转移和肿瘤血管生成有关,因而被认为是一种癌基因。研究者还认为TFF3有抑制细胞粘附,促进癌细胞侵袭,阻断细胞凋亡的作用,其高表达提示胃癌预后差。TFF1和TFF3作为检测乳腺癌细胞播散的标志物。TFF1和TFF3表达与乳腺癌、胃癌等发病,进展和预后之间的关系研究较多。但它们与结直肠癌发生、发展及临床预后等之间相关性的报道寥寥无几。Twist1基因是一种在胚胎发育过程中起关键调控作用的转录因子,是一种高度保守的碱性螺旋-环-螺旋(basichelix-loop-helix,bHLH)蛋白家族的重要成员。近期研究证实,Twist基因广泛地参与了调控器官的生长发育、肿瘤发生、细胞增殖分化等过程。Twist基因也具有癌基因的特性,能够编码凋亡抑制蛋白,影响肿瘤细胞的凋亡,抑制细胞分化、诱导上皮-间质变(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)的发生、参与肿瘤的耐药以及肿瘤血管的生成过程从而在肿瘤发生及侵袭转移过程中发挥重要的作用。研究显示TFF3的抗炎症特性可能通过对Twist的调节,因为TFF3可以持续上调Twist蛋白表达。所以我们围绕(1)TFF1,TFF3和Twist1能否在结直肠癌侵袭转移中起作用,是否与临床病理因素及预后相关(2)TFF1和TFF3促癌的作用是否与上皮-间质转化有关等两个问题展开我们的研究。第一部分：TFF1、TFF3和Twist蛋白在不同转移性结直肠癌组织中的表达目的：检测TFF1、TFF3和Twist1在不同转移性结直肠癌组织中的表达情况,了解其差异表达及其与结直肠癌临床病理特征及预后的关系。方法：(1)采用免疫组织化学方法(SP法)检测TFF1、TFF3和Twist1蛋白在75例结直肠癌、47例癌旁正常组织、30例转移淋巴结及10例肝转移灶中的表达。收集符合条件的临床病例的临床资料,进行分析。结果：TFF1和TFF3主要表达在细胞浆,胞膜亦有部分表达,而Twist1在胞浆和胞核均有表达。TFF1、TFF3和Twist在结直肠癌中表达率分别为66.7%(50/75),78.7%(59/75)和54.7%(41/75),而在癌旁正常组织中表达率为27.3%(13/47),100%(47/47)和17%(8/47)。与原发灶相比,TFF3和Twist1在转移淋巴结和肝转移灶中的表达无统计学差异(P=0.879,P=0.105forTFF3andP=0.08,P=0.780forTwist1),而TFF1在转移淋巴结和原发灶之间表达差异有统计学意义(P<0.05)。虽无统计学差异,TFF1及TFF3随转移而表达有增强趋势。TFF3和Twist1高表达与淋巴结转移、病理分期和不良预后相关(P<0.05)。TFF1高表达只与分化程度相关(P<0.05),而与预后无相关性(P>0.05)。TFF1和TFF3表达水平之间关系有统计学意义,并两者呈负相关关系(P=0.014r=-0.291)结论：TFF1、TFF3和Twist1在结直肠癌组织和癌旁组织中表达有明显差异,原发灶和不同转移灶之间亦有表达差异,但此差异达不到统计学意义。TFF3和Twist1高表达与淋巴结转移、病理分期和不良预后相关,可作为判断预后指标。第二部分：TFF1、TFF3和Twist1基因在不同转移潜能结肠癌细胞系中表达的研究目的：检测TFF1、TFF3和Twist1mRNA和蛋白在不同转移潜能结肠癌细胞系中表达情况,以了解三种基因表达与肿瘤侵袭转移的关系。方法：RT-PCR和Western-blot检测TFF1、TFF3和Twist1mRNA和蛋白在转移能力不同的人结肠癌细胞系(HT-29,SW620,LOVO)中的表达情况,以了解有无差异表达。用HIEC(永生化人类肠粘膜上皮细胞系)作对照。结果：1.TFF1、TFF3和Twist1mRNA在不同转移潜能结肠癌细胞系中表达QRT-PCR结果显示：HIEC、HT29、SW620、LOVO四种细胞株中的TFF1mRNA相对表达量分别为0.595±0.257、3.257±1.424、2.275±0.372和0。除LOVO细胞系外,其余结肠癌细胞系中TFF1表达均较正常肠上皮细胞高(P<0.05),且随细胞株转移潜能的逐渐增强,TFF1表达量逐渐降低(P<0.05)。TFF3mRNA对表达量分别为0、0.0329±0.0181、1.339±0.2168和O。可见TFF3mRNA正常肠上皮细胞系中不表达,而结肠癌细胞系中表达增高(除LOVO细胞系),且高转移细胞系SW620中表达量较低转移潜能细胞系HT29明显高(P<0.05)。TwistlmRNA相对表达量分别0.233±0.093、0.485±0.0535、1.547±0.379和3.410±0.493。可见正常肠上皮细胞系中表达低,而结肠癌细胞系中表达量均增高(P<0.05),且随结肠癌细胞系转移潜能的增强,TwistlmRNA表达量逐渐升高(P<0.05)。在高转移LOVO细胞中的’TwistlmRNA表达量显著高于其它两株,组间差异有统计学意义(P<0.05)。在转移能力较低的SW620细胞及HT29细胞中的表达均较低,两组间差别无统计学意义(P>0.05)。2.TFF1、TFF3和Twistl蛋白在转移能力不同的结肠癌细胞系中表达Western-blot结果显示：HIEC、HT29、SW620、LOVO四种细胞株中的TFF1蛋白的表达量分别为1371±114.7、26074±1413、8076±1171和343.61±91.47。除LOVO细胞系外,TFF1蛋白在结肠癌细胞系中表达量较正常肠上皮细胞系高(P<0.05),结肠癌细胞系中表达量随着转移潜能的增强而逐渐降低(P<0.05)。TFF3蛋白的表达量分别为48.22±10.60、365.6±83.51、929.20±92.95和45.69±7.11。TFF3蛋白在正常肠上皮中不表达,而结肠癌细胞系中表达量升高(除LOVO细胞系外)。随着结肠癌细胞系转移潜能的增强,表达量亦逐渐增高(P<0.05)(除LOVO细胞系外)。Twistl蛋白的表达量分别为1706±198.4、3859±166.9、3524±192.2和7831±222.2。Twistl蛋白在结肠癌细胞系中表达量较正常肠上皮细胞系高(P<0.05)。随着转移潜能的增强,Twistl表达量逐渐增高,高转移细胞系LOVO中表达量最高。结论：随着结肠癌细胞系转移潜能的升高,TFF1表达量逐渐下降,而TFF3和Twistl表达量呈逐渐上升趋势,表明TFF3和Twistl起促进转移,而TFF1在结肠癌转移中可能起保护作用。第三部分：TFF1、TFF3基因表达与上皮间质转化的关系目的：观察TFF1和TFF3以及上皮间质转化相关目标基因(Twistl,snail,E-cadherin,vimentin,β-catenin)在不同转移潜能结肠癌细胞系中的表达趋势,初步判断TFF1和TFF3是否与上皮间质转化相关。方法：应用实时定量RT-PCR和Western-blot检测HIEC、HT29、SW620、LOVO等不同转移潜能结肠癌细胞系中Twistl、snail、E-cadherin、vimentin、β-catenin等上皮间质化相关基因mRNA和蛋白表达情况,与TFF1和TFF3表达趋势对比,判断相互关系。结果：HIEC、HT29、SW620、LOVO四种细胞株中的E-cadherinmRNA表达量分别为0、7.247±2.687、0.888±0.271和0,而蛋白表达量为322.2±76.8、2281±135.6、641.1±57.4和285.6±43.46。HT29和SW620结肠癌细胞系中E-cadherinmRNA和蛋白相对表达量均较正常肠上皮细胞高(P<0.05),且随细胞系转移潜能的逐渐增强,E-cadherinmRNA和蛋白表达量逐渐降低(P<0.05)。VimentinmRNA表达量分别为0.75210.121、1.334±0.317、1.940±0.213和0.005,而蛋白表达量分别为492.8±67.5、953.1±74.8、1622±108.4和141.2±33.4。可见VimentinmRNA和蛋白在HT29和SW620结肠癌细胞系中表达较正常肠上皮细胞系高,而LOVO细胞系中不表达。高转移细胞系SW620中表达量较低转移潜能细胞系HT29无显著性差异,但较正常肠上皮细胞系明显高(P<0.05)。β-cateninmRNA表达量分别0.368±0.132、3.560±1.806、1.868±0.222和0.619±0.588,而蛋白表达量8814±1363、20962±1584、12372±1160、5096±748.5。可见正常肠上皮细胞系中表达低,而结肠癌细胞系中表达量均升高,且随结肠癌细胞系转移潜能的增强,β-cateninmRNA和蛋白表达量逐渐下降(P<0.05)。SnailmRNA表达量分别0.255±0.013、1.650±0.225、1.910±0.253和0.033±0.025,而蛋白表达量448±104.5、544±107.2、1341±84.3和130.2±26.2。可见正常肠上皮细胞系中表达低,而HT29和SW620结肠癌细胞系中表达量均升高,且随结肠癌细胞系转移潜能的增强,SnailmRNA和蛋白表达量逐渐上升趋势(P<0.05)。随着三个结肠癌细胞系转移潜能的增强,E-cadherin、β-catenin(上皮细胞标志物)的表达量逐渐下降。vimentin、snail和Twistl等(间充质细胞标志物)表达量逐渐增高。结论：TFF1和TFF3在上皮间质化过程中起一定作用,而在此过程中TFF1和TFF3可能起相反作用。第四部分：维汉民族结直肠癌患者临床病理特点及预后的对照研究目的：探讨新疆地区结直肠癌病例在维吾尔族及汉族之间的分布、临床病理特征以及预后情况。方法：收集自2000年1月至2007年12月间就诊于新疆医科大学附属肿瘤医院,经病理证实的汉族和维吾尔族结直肠癌患者1421例资料,分析并比较其分布、临床病理特征及预后情况。结果：本组1421例中,汉族1210例(年龄19～92岁,平均年龄62.3±4.5),维族211例(年龄17～87岁,平均年龄52.4±15.6)。维汉民族结直肠癌患者在性别、年龄、职业、血型、组织类型等因素构成比有显著性差异(P<0.05)。本组生存时间为7个月～122个月,平均为46.11个月。汉族患者中位总生存率、无病生存率和肿瘤相关生存率分别为45、62和65个月,而维族患者分别为42、49和61个月,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.005,P=0.007)。所有患者总生存率为1年87.0%,3年49.1%,5年16.7%。结论：维吾尔族结直肠癌患者较汉族患者具有较年轻发病,肿瘤恶性程度相对较高,预后不良的特点。应该重视此特点,开展和加强对少数民族的保健知识,对数民族聚居区广泛进行体检,做到早发现,早治疗,而提高生存率。
【作者】艾克热木·玉苏甫；
【导师】张国庆；杜建军；
【作者基本信息】新疆医科大学，外科学（专业学位），2013，博士
【关键词】结直肠癌；维吾尔族；汉族；临床病理特点；预后；

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