靶向Neuropilin-1单克隆抗体对皮肤癌细胞生长抑制作用及其机制的研究

【摘要】研究背景和目的在日照丰富的国家,皮肤癌的患病率极高,其病因复杂,发病机制各异,而传统的放疗、化疗手段存在抗肿瘤效果差、副作用大等一系列缺点。分子靶向治疗却有着良好的肿瘤靶向性和较低的毒副作用,为癌症治疗提供了新的治疗手段。近期研究显示神经鞭毛素蛋白-1(Neuropilin-1,NRP-1)是癌症治疗的新靶标,NRP-1是一个新型的多功能受体,是I型跨膜糖蛋白。NRP-1可作为轴突导向因子3(semaphorin3,Sema3)、血管内皮细胞因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)等多种细胞因子的共受体,参与调控多种细胞因子介导的经典信号通路,同时其本身也具有独立的信号通路,与肿瘤血管新生及肿瘤的发生发展密切相关。许多实验证明NRP-1在皮肤癌上有较高的表达,并与其发生发展密切相关,但作用机制尚不清楚。本文旨在检测本实验室制各的抗NRP-1单克隆抗体(NRP-1mAb)对皮肤癌细胞株生存的影响,并探讨其作用机制,为发展一种以NRP-1为靶标的新型抗肿瘤策略奠定基础。实验方法利用Balb/c鼠生产NRP-1mAb;rProteinA柱纯化抗体；SDS-PAGE蛋白电泳检测抗体的纯度和浓度；间接ELISA鉴定抗体活性；流式细胞术、Westernblotting、细胞免疫荧光及免疫组化检测NRP-1mAb的特异性及NRP-1蛋白在皮肤癌细胞株和皮肤癌组织上的表达情况；光镜观察NRP-1mAb对细胞形态的影响；细胞抑制实验(MTT)和集落形成抑制试验检测NRP-1mAb对皮肤癌细胞株增殖的影响；流式细胞术和细胞核荧光染色检测NRP-1mAb对皮肤癌细胞株凋亡的影响；Westernblotting检测凋亡相关蛋白(Caspase-3、Bax、Bcl-2)和增殖相关蛋白(PI3K、p-Akt、Akt、p-ERK1/2、ERK1/2)的表达,分析NRP-1mAb对PI3K/Akt和MEK/ERK信号通路的激活情况,探讨NRP-1mAb对皮肤癌细胞的作用机制。实验结果制备纯化的NRP-1mAb纯度高达96.5%,效价约为1×10-6,同时不同批次效价类似,表明其活性稳定。NRP-1mAb与NRP-1blb2蛋白、B16F10细胞和A431细胞分别在39KDa、100KDa和130KDa处均有特异性的结合带。两株皮肤癌细胞株及皮肤癌组织上NRP-1抗原表达呈阳性,主要定位于细胞膜上,且A431表达更高；MTT结果显示NRP-1mAb能抑制皮肤癌细胞株A431和B16F10的增殖,且抑制作用与剂量和时间正相关。细胞集落形成抑制实验结果表明,不同浓度抗体均可显著抑制细胞集落的形成,并呈剂量依赖性。细胞核Hoechst33258荧光染色、流式细胞术结果表明NRP-1mAb可诱导皮肤癌细胞凋亡,并呈剂量依赖性。Westernblotting检测到NRP-1mAb作用皮肤癌细胞后Bax表达上调、Caspase-3的剪切带增加,Bcl-2、PI3K(85)、p-Akt、p-ERK1/2表达下调。结论1.本课题成功制备了高纯度、高效价且效价稳定的NRP-1mAb。2.NRP-1mAb能特异性的结合皮肤癌细胞上NRP-1蛋白,且皮肤癌细胞及皮肤癌组织上高表达NRP-1。3.NRP-1mAb能显著抑制皮肤癌细胞的生长并呈时效、量效关系。4.NRP-1mAb对皮肤癌细胞的生长抑制作用与下调PI3K/Akt和MEK/ERK信号通路相关。
【作者】吕莎；
【导师】颜江华；
【作者基本信息】厦门大学，药理学，2014，硕士
【关键词】Neuropilin-1；单克隆抗体；皮肤癌；增殖；凋亡；

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