骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性肝衰竭的作用研究

【摘要】目的：(1)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行体外培养、鉴定。(2)对D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导的急性肝衰竭(ALF)大鼠给予尾静脉、门静脉二种途径注射同种异体移植大鼠BMSCs,探讨BMSCs移植治疗ALF的可能性、对比两种移植途径的疗效。(3)通过测定各组血清及肝组织中细胞因子的表达,探讨BMSCs移植治疗ALF的机制、了解BMSCs在肝内归巢的影响因素、探讨BMSCs移植对ALF血清和肝组织中细胞因子表达及肝细胞凋亡的影响及机制,为临床开展BMSCs移植治疗ALF、为临床提供可靠的ALF预后评估系统、实时准确地评价ALF的免疫状态、病情及预后并指导临床治疗提供依据。方法：(1)采用全骨髓贴壁法分离大鼠BMSCs,进行体外培养。采用DAPI标记BMSCs、细胞免疫荧光、流式细胞术进行BMSCs表型鉴定。(2)采用10%D-氨基半乳糖1-4g/kg/次、12小时一次和0.005%脂多糖20μg/kg,经腹腔注射制备大鼠ALF模型,观察造模后大鼠肝功能、肝组织病理损害程度。(3)通过尾静脉和门静脉注射的方式移植BMSCS。66只大鼠随机平均分为对照组、尾静脉移植、门静脉组。各途径组同种异体移植BMSCs,移植BMSCs数量为1.4×107个/kg,对照组给予等体积生理盐水腹腔注射。于移植后24h、72h、120h、168h收集血液样本和肝组织标本。检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST),比较BMSCs移植前后各组肝功能的改善情况。(4)用HE染色观察肝脏的病理学变化。用TUNEL法检测肝细胞凋亡。采用ELISA、RT-PCR方法测定各组血清及肝组织内CD163、IL-10的水平。用原位杂交、Westernblot方法检测肝组织基质细胞衍化生长因子-1α(SDF-1α)蛋白的表达水平；用免疫荧光组织化学法、RT-PCR方法检测肝组织血管内皮生长因子VEGF蛋白的表达；采用免疫组化、Westernblot方法检测肝组织Caspase-1、IL-18蛋白的表达水平。结果：(1)原代培养的大鼠BMSCs传代后,高表达CD29和CD90,不表达CDllb和CD45。用DAPI进行BMSCs标记,荧光显微镜下观察可见所有BMSCs均已标上蓝色荧光。(2)采用了D-氨基半乳糖模型(D-Gal)/脂多糖(LPS)诱导的大鼠ALF模型。模型建立后,组织HE染色出现典型急性肝损伤表现,肝衰竭对照组大鼠血清ALT.AST水平和肝细胞凋亡较BMSCs移植组明显升高,且有时间依赖性,这些结果支持了建模成功。(3)ALF对照组大鼠血清ALT、AST水平随病程逐渐升高,在移植后120h、168h,尾静脉、门静脉组移植组血清ALT、AST水平与对照组的差别均有统计学意义(P<0.01),尾静脉与门静脉移植组之间血清ALT,AST水平的差别无统计学意义(P>0.05)。(4)BMSCs移植后168h,尾静脉与门静脉移植组大鼠肝组织均可见大量DAPI阳性标记的细胞,ALF模型对照组未见DAPIP日性标记的细胞。(5)BMSCs移植后120h、168h,尾静脉移植组、门静脉移植组的炎性细胞浸润明显减少,肝小叶结构逐渐恢复,汇管区可见胆管增生。尾静脉组移植组、门静脉移植组肝组织炎症改善情况与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。尾静脉组移植组、门静脉移植组肝组织炎症改善情况的差别无统计学意义(P>0.05)。(6)在移植后120h、168h,与对照组相比BMSCs移植组肝细胞凋亡明显减轻(P<0.05)。BMSCs移植后120h尾静脉组、门静脉组细胞凋亡指数分别为22.00±16.84%、20.60±7.60%；移植后168h细胞凋亡指数分别为18.33±8.78%、12.67±8.78%,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。尾静脉和门静脉植组之间肝细胞凋亡改善情况无统计学差异(P>0.05)。(7)原位杂交、免疫荧光、Westernblot结果显示：BMSCs移植组中SDF-1α、VEGF蛋白的表达水平随肝功能的好转逐渐逐渐升高,在移植后120h、168h与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。尾静脉和门静脉植组之间肝组织SDF-1α、VEGF蛋白的表达水平无统计学差异(P>0.05)。相关分析发现肝组织中SDF-1α、VEGF两者表达水平呈正相关(P<0.05)。肝组织中SDF-1α、VEGF蛋白的表达与肝细胞凋亡之间存在负相关,相关系数分别0.293、-0.274(P<0.05)。(8)ELISA及RT-PCR结果显示：ALF对照组大鼠血清及肝组织中CD163、IL-10的水平随时间的延长、肝功能的恶化而升高。BMSCs移植组血清及肝组织中CD163、IL-10的水平随肝功能的好转逐渐降低,在移植后120h、168h与实验组相比有显著差异(P<0.01)。门静脉与尾静脉移植组血清及肝组织中CD163、IL-10的水平之间的差别无统计学意义(P>0.05)。相关分析发现血清及肝组织中CD163、IL-10两者表达水平呈正相关(P<0.05)。CD163IL-10与ALT、AST之间均有明显的相关性(P<0.01)。(9)大鼠肝组织中Caspase-1、IL-18蛋白及蛋白的表达趋势一致,BMSCs移植后大鼠肝组织中Caspase-1和IL-18水平明显下降,在移植后120h、68h、BMSCs移植组中Caspase-1、IL-18蛋白的表达水平与对照组相比有显著差异(P<0.05)。门静脉组与尾静脉移植组之间Caspase-1、IL-18蛋白的表达差别无统计学意义(P>0.05)。尾静脉和门静脉植组之间Caspase-1、IL-18蛋白的表达无统计学差异(P>0.05)。相关分析发现Caspase-1、IL-18两者呈正相关(P<0.05);Caspase-1、IL-18肝细胞凋亡之间均有明显的相关性(P<0.01)。结论：(1)采用全骨髓贴壁筛选法可以成功分离培养、扩增出高纯度大鼠BMSCs,并保持其原有的生物学特性。DAPI可成功标记BMSCs。(2)采用10%D-Gall.4g/kg/次,间隔12小时,共两次。联合0.005%LPS(10mg/支)20μg/kg、腹腔注射可成功建立大鼠ALF模型。该方法可靠、可重复性强、模型形成稳定、大鼠生存期较长,能满足本研究的需要。(3)BMSCs尾静脉、门静脉移植后,BMSCs可以归巢到ALF大鼠肝脏。(4)BMSCs移植能够促进ALF大鼠肝功能的恢复,减轻肝脏组织炎症坏死程度,BMSCs对ALF大鼠具有一定治疗作用。(5)尾静脉移植、门静脉移植途径均能有效改善ALF大鼠的肝功能、减轻肝脏病理损害程度。但二种途径相比差异无统计学意义。(6)BMSCs移植可减少ALF肝脏免疫炎症反应,抑制肝细胞凋亡。(7)BMSCs可以特异归巢至损伤肝脏,促进VEGF的分泌、并促进肝细胞增殖及肝脏血管再生、促进肝脏组织修复。(8)CD163.IL-10水平随肝组织炎症程度改善而下降,反映了肝功能的急剧恶化和疾病严重程度。BMSCs移植能降低CD163、IL-10水平,调节促炎与抗炎因子达到新的平衡。CD163、IL-10可作为早期评估患者肝移植预后观察的敏感血清标志蛋白的指标。(9)Caspase-1和IL-18在肝衰竭、肝细胞凋亡的发病过程中起重要作用。BMSCs移植能降低Caspase-1、IL-18水平。Caspase-1和IL-18可望成为急性肝衰竭的预测因子和未来的治疗靶点。
【作者】袁淑芳；
【导师】张跃新；
【作者基本信息】新疆医科大学，内科学（专业学位），2013，博士
【关键词】骨髓间充质干细胞；急性肝衰竭；移植；细胞因子；

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