Fyn在神经元迁移中的作用及分子机制研究

【摘要】哺乳动物大脑皮质是一个高度有序的六层结构，其片层结构是按照“由内向外”的模式发育而来的，在此过程中，神经元沿着放射状胶质细胞由室层(VentricularZone)向边缘层(MarginalZone)进行放射状迁移并受许多内外因素的共同调控。大脑发育早期，大多数神经元在产生后必须迁移至目的地后才形成突触联系，发挥其功能作用，神经元迁移障碍会导致大脑发育异常和畸形，并引起神经系统功能障碍和疾病，比如癫痫，智力低下，平滑脑等。Fyn是酪氨酸激酶家族(SFK)的成员之一，Fyn不仅在神经元迁移以及大脑皮质层状结构的形成过程中有重要作用，而且参与多种细胞信号通路如摇晃蛋白(Reelin)信号通路，调控神经元迁移。Fyn是一种非受体型酪氨酸激酶，分子量约为59KD，其分子结构从N端到C端依次是：SH3结构域(Srchomology3domain)，SH2结构域(Srchomology2domain)和蛋白激酶结构域(TyrKc)。Fyn在大脑皮质发育过程中表达水平很高，Fyn基因敲除鼠的大脑皮质形态和结构发生异常，神经元排列紊乱。此外，神经元迁移依赖Fyn调节细胞骨架的重排，细胞骨架主要包括肌动蛋白构成的微丝和微管蛋白构成的微管，细胞骨架的重排和细胞之间的粘附以及神经元与放射状胶质细胞的紧密联系在神经元迁移过程中起到非常关键的作用。这些结果表明，Fyn通过参与调节信号转导来调控神经元迁移，尽管Fyn缺失会导致哺乳动物大脑皮层神经元的迁移障碍和大脑皮质层状结构形成异常，但是Fyn在神经元迁移中的详细作用机制仍不十分清楚。因此本实验构建了Fyn的豆蔻酰化、棕榈酰化和甲基化检测位点的突变体以及灭活SH3区域、灭活SH2区域、激酶缺失型、致死性突变、持续性活化等Fyn突变体以及RNA干扰载体，通过载体构建、细胞转染等分子细胞生物学技术，子宫内电击转染、免疫组化、激光共聚焦显微镜、延迟成像等形态学技术相结合，研究和分析Fyn对神经元迁移的作用和影响，这对阐明神经元迁移的机理和大脑发育的分子机制具有科学价值和意义。主要研究结果如下：1.Fyn作用于伪足运动(板状伪足和丝状伪足)的分子机制可通过细胞形态变化来进一步诠释。Fyn基因的克隆使用pEGFP-N1和pCAG-GFP载体。转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)后，分别通过RT-PCR和Westernblot检测Fyn的mRNA和蛋白质表达，同时一些转染Fyn的细胞用DAPI染色，一些转染Fyn的细胞采取实时动态观察其形态变化。结果表明，转染重组载体的细胞形态变化显著，小鼠Fyn在中国仓鼠卵巢细胞中过度表达引起丝状伪足和片状伪足形成和细胞运动。2.Fyn不仅参与细胞增殖、分化和皮层形成，也参与细胞生长和细胞骨架运动变化。我们的结果表明，转染了重组载体的CHO细胞形态变化明显，应力纤维的数量降低以维持丝状伪足和板状伪足的形成，但纽蛋白和微管蛋白的变化不明显。此外，高浓度的Fyn可以促进丝状伪足和板状伪足的形成。本部分的实验结果表明，小鼠Fyn过度表达引起了F-肌动蛋白细胞骨架重排，而纽蛋白和微管蛋白可能在Fyn介导的F-actin重排过程中不发挥直接作用。3.Fyn的第531位氨基酸Y531位于C末端，其作用是负调节其活性。在本实验中，Fyn的激活型突变体是将Y531突变为F(称为Fyn的持续性活化突变，FynCA)，而致死型突变则是由K299变成A，突变的氨基酸是ATP结合域内的一个关键结合位点(Fyn的致死型突变，FynDN)。结果表明，过度表达Fyn的不同突变体会导致神经元发生显著的形态学变化并影响神经元迁移，而且作为一种肌动蛋白相关蛋白，Fyn能通过促进肌动蛋白的解聚进而影响大脑皮质神经元正常迁移。我们的研究结果表明Fyn是维持神经元迁移过程中调节细胞骨架变化的一个重要因子。4.Fyn的两个突变体，Fyn259(无蛋白激酶突变)和Fyn390(FynD390A)，被用来研究其对皮质发育中神经元迁移的影响。结果发现，转染这两种突变体生后1天(P1)，皮质板(Corticalplate,CP)的GFP阳性神经元数量增多，并促进总FAK(T-FAK，黏着斑激酶)增加。我们的结果也表明了过表达Fyn390（而不是Fyn259突变）会导致细胞明显的形态变化，损伤神经元迁移，Fyn酪氨酸激酶结构域对于放射状迁移是不可缺少的。综上所述，Fyn第390位天门冬氨酸是维持皮质发育和神经元迁移的一个关键激酶位点。
【作者】安磊；
【导师】赵善廷；
【作者基本信息】西北农林科技大学，神经生物学，2014，博士
【关键词】Fyn；神经元迁移；FAK；子宫内电击转染；细胞骨架；

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