转不同外源基因提高薯类作物抗逆能力的研究

【摘要】薯类作物又称为根茎类作物，主要包括马铃薯、甘薯和木薯等以块根块茎为主要粮食、饲料及工业加工材料来源的作物。薯类作物在我国的粮食生产中排第四，种植面积达到了1.3亿亩。薯类作物共有的特性为耐瘠、耐旱、适应力广，为高产救荒类作物，且都以无性繁殖为主。在我国，薯类作物主要种植于北方干旱半干旱地区，而日益严重的干旱及其他环境问题也严重制约了当下粮食作物的生长和产量，因此，提高薯类作物的抗逆能力及产量形成，对我国北方地区的农业发展有着重要的意义。在本研究中，以甘薯和马铃薯这两种主要的薯类作物为实验材料，采用或培育了外源超表达不同具有提高植物抗逆能力基因的转基因植株，通过以水分胁迫和盐渍胁迫为主的非生物胁迫的室内实验处理，对转基因植株和对照株在产量构成、抗氧化酶系统、氧化伤害、光合作用及基因表达等方面进行了研究，以此探讨超表达不同基因的转基因甘薯或马铃薯对逆境胁迫的生理响应机制。主要研究内容如下：1.采用盆栽控水方法，在甘薯的薯块膨大期共设置正常供水（土壤含水率为田间最大持水量的80%）；中度胁迫（土壤含水率为田间最大持水量的60%）和重度胁迫（土壤含水率为田间最大持水量的40%），实验材料为转Cu/ZnSOD和APX基因的转基因甘薯（TS）及非转基因甘薯（NT）。结果表明，TS中的SOD及APX酶的活性、可溶性糖含量均高于NT，但是POD酶则表现出相反的趋势。随着干旱程度的加剧，两个株系甘薯中的APX酶活、可溶性糖含量、光合速率及蒸腾速率均逐渐降低。虽然从干旱的第20天到第70天两株系甘薯中的光合参数均表现出下降的趋势，但净光合速率在TS和NT之间没有显著的差异。在中度胁迫下两株系甘薯中的产量最高而在重度胁迫下最低，其中TS的产量显著高于NT。在不同的水分条件下，TS的气孔导度和蒸腾速率显著低于NT，因而降低了水分的散失，使水分利用效率增高。实验说明，在薯块膨大期，干旱胁迫下超表达的Cu/ZnSOD和APX基因能够提高转基因甘薯中SOD和APX酶的活性、可溶性糖的含量和水分利用效率，最终提高了甘薯的产量。2.马铃薯是重要的粮食作物之一，在全世界范围内，已经培育出了上千种的不同基因型的马铃薯品种。马铃薯主要种植于干旱半干旱地区，因此，马铃薯的抗逆能力是应对环境胁迫的最主要的因素。本实验的实验目的是将五种来自不同地区的马铃薯品种，经过干旱、盐渍、高温和氧化胁迫不同的环境胁迫处理，从这几个品种中筛选出对一种或几种胁迫具有更强抗性的品种。实验结果表明，由中国甘薯农科院马铃薯研究所培育的马铃薯品种陇薯三号对干旱，盐渍以及氧化胁迫有较强的综合抗性，主要表现为具有更强的SOD和APX酶活性，更强的根系生长能力和根干重，但是该品种对高温相对敏感。美国的Superior这一马铃薯品种与陇薯三号的特性相反，表现出对高温有很强的耐受性，在经过24小时的38℃高温处理后叶片含水量和Fv/Fm仍维持在较高水平，但对干旱和盐渍敏感。富含花青素的JaYoung品种，表现出了较强的综合抗性，与花青素这一抗氧化剂有密不可分的关系。3.可以被胆碱氧化酶（COD）催化合成的甜菜碱，在植物体中是具有很强地活性氧清除能力的可溶性物质，同时也具有保护光和系统和大型功能蛋白的能力。为了研究胆碱氧化酶（CodA）基因对马铃薯耐旱能力及旱后恢复能力的影响，本实验对外源转入胆碱氧化酶的转基因马铃薯（SC）及其野生型对照株（NT）进行了中度和重度的水分胁迫处理，以此研究外源转入的胆碱氧化酶对马铃薯抗旱及旱后修复能力的影响。实验包括一个持续两天，用20%PEG进行的预处理实验，和一个由四天水分胁迫处理和两天旱后恢复组成的胁迫处理实验两部分。在四天的水分胁迫处理中，植物被分别置于对照（0%PEG），中度胁迫（10%PEG）和重度胁迫（20%PEG）三种水分处理中，在第五天时对所有的马铃薯植株提供正常的水分条件使其恢复。预处理实验的结果证明了CodA基因在转基因马铃薯中的表达和甜菜碱在马铃薯中的积累，同时其水势也显著高于对照植株。在胁迫及修复的处理中，SC相对于NT表现出更强的抗氧化能力，更高效的光和系统，更高的叶绿素含量，较低的MDA含量以及更好的旱后修复能力。4.农杆菌侵染法是在马铃薯遗传转化研究中应用较为成熟的方法，在本实验中采用的农杆菌载体为pCAMBIA2300。首先将由甘薯中克隆得到了IbMYB1基因转入农杆菌载体中，利用叶盘法将农杆菌与马铃薯叶片组织进行共培养后，通过诱导愈伤组织和愈伤组织分化以获得新的拟转基因再生马铃薯株系。通过大量的组培工作，卡那霉素筛选，对质粒DNA的基因特异性引物的PCR分析，证实了已经成功了将外源基因整合到了马铃薯基因组中，共获得了11个IbMYB1转基因株系。再通过高温胁迫后的RT-PCR分析，IbMYB1基因能够在SWPA2启动子的调控下在转录水平上进行表达，并以此为基础筛选出了两个基因表达量较高的株系：SM5和SM12。5.IbMYB1是属于R2R2-MYB这一个大的转录因子家族中的一个转录因子，已有的研究表明它的功能主要表现为调控植物中花青素的合成。在前一个阶段的实验中，IbMYB1已经被成功的转入了马铃薯陇薯三号中，且经过筛选最终确定了SM5和SM12两个转基因株系为生理阶段实验材料，同时将转入空白载体的转基因株系作为对照株系，在本研究中，对三个株系进行盐胁迫处理，以研究外源基因对转基因马铃薯在盐胁迫处理下的生理调控。结果表明，IbMYB1基因表达量显著增强的转基因株系在含NaCl的培养基中受到的抑制更低，根干重显著高于对照。同时，在用含300mMNaCl的水浇灌六天的马铃薯植株中，相对于对照，转基因株系中积累了更多的次生代谢产物，更强的活性氧清除能力和更高的光和特性。这些结果说明转基因马铃薯具有更强的抗盐渍能力。在转基因马铃薯中类黄酮类化合物合成途径中的几个关键酶的基因的表达量由于受到了导入的转录因子IbMYB1的调控，在干旱、盐和紫外胁迫下的表达量均高于对照，且具有更强的抗性。
【作者】成雨洁；
【导师】邓西平；
【作者基本信息】西北农林科技大学，生态学，2014，博士
【关键词】转基因甘薯；转基因马铃薯；耐逆性；抗氧化酶系统；次生代谢产物；

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