不同毛色羊驼皮肤microRNAs的全基因组表达谱分析和功能研究

【摘要】哺乳动物的毛色主要由皮肤与毛发黑色素的种类、数量及分布情况所决定。研究发现能够调控黑色素细胞发育、迁移的基因,及能够影响色素形成的内分泌因子都可以调控动物毛色的形成。例如：MITF、TYR、TYRP-1、TYRP-2/DCT、MC1R、K1T、α-msh、Agouti蛋白基因等。microRNAs(miRNAs)是一类长度为22nt左右的单链小RNA,通过转录后调节机制参与动植物机体生理生化发育、发生和疾病发生等多个过程。多个研究发现miRNAs可调控动物皮肤形态发育和发生,皮肤肿瘤疾病发生和皮肤创伤修复等方面。但是关于miRNAs在动物毛色形成中的调控研究相对较少。本研究以毛色丰富的羊驼作为研究对象,应用下一代深度测序技术对不同被毛颜色羊驼皮肤miRNAs表达谱进行全基因组分析,筛选出一组有可能参与毛色形成的miRNAs,并利用生物信息学方法和报告载体验证可能参与毛色调控miRNA的靶基因,构建miRNA过表达载体,转染羊驼黑色素细胞分析miRNA靶基因、毛色形成主效基因mRNA和蛋白量的变化以及色素含量的变化,揭示miRNA在羊驼毛色形成中的作用机制。1.利用下一代深度测序技术分析白色和棕色羊驼皮肤miRNA的表达谱,在白色和棕色羊驼皮肤中分别发现272和267个保守性成熟miRNAs;进一步分析不同被毛颜色羊驼皮肤中已知miRNAs的表达差异,获得48个存在显著差异的miRNAs;利用GeneOntology和KEGG数据库对miRNAs靶基因进行分类,发现257个调控通路,其中包括色素形成通路；与羊驼基因组、牛基因组和miRBase数据库中所有已知动物miRNAs进行比对,在白色和棕色羊驼皮肤中分别获得55和64个羊驼皮肤所特有的新miRNAs。2.基于miRNAs深度测序表达谱,挑选一组miRNAs,应用RNA加尾和引物延伸的荧光定量方法对其在不同被毛颜色羊驼皮肤中的表达量进行检测,验证测序结果。荧光定量结果表明,miR-202,miR-211,miR-27a,在白色和棕色羊驼皮肤中的表达量存在显著差异,变化趋势和测序数据库结果一致,推测其可能参与羊驼毛色的形成。3.miRNAs通过转录后调控作用抑制相应靶基因的翻译,参与细胞发生、分化、发育、代谢、凋亡和肿瘤转移等多个生物学过程。研究miRNAs的功能,关键是确定miRNAs靶基因。目前miRNAs靶基因的确定方法主要通过生物信息学软件进行预测及实验方法进行验证。miR-211在棕色羊驼皮肤中的表达量最高,是白色羊驼的17倍。因此我们选取miR-211进行功能研究。通过miRanda,PITA和miReap三种不同的生物信息学软件对miR-211靶基因进行预测,PCR扩增几种预测方法中共有靶基因KIT的3’-UTR,再用RNAhybrid软件对miR-211和靶基因的结合位点进行验证,获得很好的结合效果;构建靶基因KIT3’-UTR双荧光报告载体和miR-211过表达载体,共转染细胞验证miRNAs和KIT的互作关系;同时利用RT-PCR对黑色素形成通路上主要毛色调控基因KIT,TYR,MITF,TYRP-1,TYRP-2进行内源性检测。4.KIT是毛色形成通路上的调控基因,因此我们推测miR-211可以通过调节KIT基因参与毛色形成。通过在羊驼黑色素细胞中转染miR-211,分析转染后miR-211、KIT和MITF等基因及色素的变化,确定miR-211对色素形成的影响。结果显示,miR-211转染组KIT基因mRNA水平低于阴性对照组,但并不存在显著差异。MITF、TYR和TYRP-1mRNA表达量显著高于阴性对照组,TYRP-2mRNA在转染组和阴性对照组之间没有显著差异；miR-211转染组KIT蛋白水平显著低于阴性对照组,但是MITF、TYR和TYRP-1蛋白水平相对升高；miR-211转染组色素含量明显高于对照组。因此,我们推测miR-211参与羊驼毛色形成的调控。本研究对不同毛色羊驼皮肤miRNAs表达谱进行全基因组分析,发现了一组可能参与毛色形成的miRNAs,并对其中在棕色被毛羊驼皮肤中最显著表达的miR-211进行功能分析,通过靶基因预测、筛选,荧光报告载体验证KIT为其候选靶基因；构建miR-211真核表达载体转染羊驼黑色素细胞,发现miR-211可以抑制KIT蛋白的表达,影响MITFmRNA和蛋白表达,使色素合成关键基因TYR,TYRP-1和TYRP-2mRNA和蛋白表达量得到不同程度的提高,最后使色素的合成量显著增高。这一研究为将来大批量开展miRNAs调控毛色形成提供了实验模式,也为miRNAs参与毛色形成机制提供了有力的证据。
【作者】田雪；
【导师】董常生；
【作者基本信息】山西农业大学，动物遗传育种与繁殖，2013，博士
【关键词】羊驼；miRNAs；下一代深度测序；miR-211；RNAhybrid；双荧光报告载体；黑色素细胞；

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