脊髓康对大鼠脊髓损伤后轴突再生微环境的作用机制研究

【摘要】背景：研究发现,SCI后神经营养因子缺乏、髓鞘相关抑制分子的产生等是影响轴突再生微环境的重要原因。中医药以其多因素、多靶点的优点,正逐步成为改善神经再生微环境的研究热点。“脊髓康”是我们在中医“肾督同治”理论指导下,结合多年的临床实践而形成的验方,具有“祛瘀通督,滋补肝肾,调和气血.”之功效,前期的临床及初步实验研究证实,脊髓康可促进SCI患者神经功能恢复,抑制脂质过氧化,清除氧自由基,改善损伤局部微环境,我们推测“脊髓康”这一效应可能与其促进相关神经营养因子表达、抑制髓鞘相关抑制分子等作用关联。目的：进一步明确中药“脊髓康”对SCI后神经功能恢复及脊髓组织病理改变的影响,探讨“脊髓康”对BDNF、NGF及NgR神经再生生相关调控因子及受体表达的影响,分析“脊髓康”改善损伤轴突再生微环境的可能作用机制。方法：清洁级SD大鼠210只,雌性,体重180-220g,30只用于SCI动物模型的评价,180只用于正式实验。运用改良Allen’s法建立大鼠的脊髓损伤动物模型。假手术组仅单纯咬除T9-T11段椎板、棘突。随机抽取30只大鼠作为假手术组,其余150只大鼠造模成功后随机分为5组,即模型组、强的松组、脊髓康高剂量组、脊髓康中剂量组、脊髓康低剂量组,每组30只。各组大鼠均于麻醉苏醒后30min即开始给予处理,强的松组给药0.06g/(kg.d),脊髓康中剂量组给药25g/(kg.d),高剂量组给药50g/(kg.d),低剂量组给药12.5g/(kg.d)。各组均按体积20m1/(kg.d)灌胃给药。假手术组和模型组均灌胃以同等剂量的生理盐水。分别于术后24h、3d、7d、14d,对各组大鼠进行BBB评分、斜板试验,干预后3d、7d、14d处死大鼠取脊髓组织样本,HE染色、透射电镜观察各组脊髓组织结构的变化,ELISA法分析大鼠SCI后血.清BDNF、NGF的表达情况,免疫组化、westernblot、荧光定量PCR法检测大鼠SCI后脊髓损伤区BDNF、NGF及NgR蛋白、mRNA的表达情况。结果：(1)术后不同时间点BBB评分及斜板试验比较,模型组均显著低于假手术组(P<0.01)。HE染色显示正常对照组、假手术组脊髓组织结构清晰,神经元未见胞体肿胀、胞核固缩、坏死等病理改变,间质无炎性细胞浸润,而模型组脊髓组织结构破坏,神经纤维排列紊乱,可见神经元固缩、坏死、溶解,出现片状出血灶。(2)术后24h各组大鼠BBB评分、斜板试验角度显著低于假手术组(P<0.01)。术后3d-14d脊髓康中剂量组与强的松组行为学评分均高于模型组(P<0.05),而两组间比较无明显差异(P>0.05),术后7d各治疗组大鼠的后肢活动改善均较为明显,但脊髓康中剂量组与强的松组未见明显差异(P>0.05),术后14d脊髓康中剂量组BBB评分显著高于其他各组,与强的松组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。(3)HE染色显示：模型组脊髓组织结构破坏,组织疏松,神经纤维间隙重度增大,可见神经元固缩、坏死、溶解,并呈进行性加重,强的松组及脊髓康各治疗组也见脊髓结构破坏,部分神经元固缩、坏死、溶解,但随着干预时间延长,神经元存活较模型组明显,神经元水肿、坏死情况较轻,尤以强的松组、脊髓康中剂量组脊髓组织改善较为明显；透射电镜结果表明,模型组伤后3d到7d内病变呈进行性加重,少部分发生不可逆性的损害,强的松组及脊髓康组亦可见髓鞘变性,板层分离,部分轴突水肿、凝固变性,部分轴索内可见线粒体,但结构较为清晰。(4)ELISA结果显示,SCI后大鼠血清BDNF、NGF都有不同程度的升高,但维持时间较短。术后3d各组BDNF、NGF均较假手术组有显著升高,术后7d-14dBDNF仍维持在较高水平,而NGF的表达水平略有下降。各时间点统计结果显示,强的松、脊髓康均能有效促进SCI后血清BDNF、NGF的表达,并维持在较高水平,术后7d-14d强的松组与脊髓康中剂量组相比未见明显差异(P>0.05)。(5)免疫组化及WesternBlot显示,大鼠SCI后脊髓损伤区BDNF、NGF都有不同程度的升高,与ELISA结果一致。不同时间点强的松组及脊髓康组BDNF、NGF表达水平较模型组均有显著升高,其中BDNF术后7d-14d仍维持在较高水平,而NGF的表达水平7d后均略有下降。大鼠SCI后脊髓损伤区高度表达NgR,而强的松、脊髓康可由有抑制脊髓损伤区NgR蛋白的表达,不同时间点比较,均较模型组显著降低(P<0.05)。(6)荧光定量PCR显示,强的松、脊髓康可促进SCI后脊髓损伤区BDNF、NGFmRNA的表达,抑制NgRmRNA的表达。SCI后早期,强的松效果较为明显,脊髓康的治疗效应亦明显优于模型组,且中剂量组效应最佳,但与强的松组相比,作用缓慢,而干预后14d,脊髓康中剂量组BDNF、NGFmRNA仍维持在较高水平,同时NgRmRNA表达水平较低。结论：(1)本研究采取的大鼠改良Allen’s造模方法可行,稳定性好,易于复制。(2)强的松、脊髓康均可促进大鼠SCI后后肢运动功能的恢复,十预7d后中药的整体调节作用更为显著。(3)强的松、脊髓康均可较好地减轻和延缓脊髓损伤后的病理损害程度,阻止不可逆性的变性现象的发生和发展。(4)强的松、脊髓康均可促进SCI后血清及髓内BDNF、NGF蛋白及mRNA的表达,抑制NgR蛋白及mRNA的产生，且强的松在SCI早期效应较为明显,而中药脊髓康药效作用持久,长时间仍可维持有效效应浓度,提示脊髓康在SCI后中晚期的整体调节作用优势明显,这可能是中药脊髓康促进神经功能恢复,改善轴突再生微环境的作用机制之一。
【作者】孙福荣；
【导师】许建安；
【作者基本信息】南京中医药大学，中医骨伤科学，2013，博士
【关键词】脊髓康；脊髓损伤；微环境；BDNF；NGF；NgR；

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