雷公藤红素对LP-1多发性骨髓瘤细胞株增殖凋亡及NF-κB信号通路的作用研究

【摘要】目的和意义：研究雷公藤红素对于人多发性骨髓瘤LP-1细胞的增殖、细胞周期、凋亡、血管生成能力及NF-κB信号通路的影响。实验方法：采用台盼蓝活细胞染色法研究雷公藤红素对多发性骨髓瘤细胞生长曲线的影响。采用CCK-8细胞活力检测法研究了雷公藤红素对LP-1多发性骨髓瘤细胞体外增殖活力的抑制作用及其IC50值。采用碘化吡啶(PI)染色法流式细胞术分析雷公藤红素对细胞周期的调控作用。进一步采用Westernblot法检测不同浓度雷公藤红素作用前后对LP-1细胞内CyclinD1,P21wap1/cip1和P27kip1细胞周期调控蛋白表达的影响。通过AnnexinV-EGFP荧光染色法采用荧光显微镜定性观察了雷公藤红素对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响,采用流式细胞术定量检测了雷公藤红素对多发性骨髓瘤细胞凋亡百分率的影响,进一步采用Westernblot法检测不同浓度雷公藤红素作用前后对LP-1细胞内Bcl-2,Bax及Survivin等细胞凋亡相关蛋白的表达水平,特异性底物显色法检测雷公藤红素了对Caspase-3酶原活化的影响。划痕法检测雷公藤红素对血管内皮细胞体外血管生成能力的影响；Transwell小室测定不同浓度雷公藤红素对于HUVECs侵袭力的影响,LUMINEX测定细胞培养上清液中VEGF水平。流式细胞术检测雷公藤红素对LPS刺激后细胞表面TLR-4表达的影响、Westernblot检测不同浓度雷公藤红素对LPS刺激后p65,IκBα激酶(IκBαkinase,IκKα),IκBα的表达；免疫荧光染色法观察雷公藤红素对LPS刺激后LP-1细胞内NF-κB/p65和IκBα定位的影响。结果：雷公藤红素对人多发性骨髓瘤LP-1细胞的生长曲线具有明显的抑制作用,这种效应具有明显的剂量-效应关系。雷公藤红素作用浓度为2μM时即可引起细胞生长停滞,其IC50为0.8817μM。雷公藤红素以不同浓度作用24小时后随着雷公藤红素浓度增加,人多发性骨髓瘤细胞进入G1期比例明显增多,S期细胞明显减少(**p<0.01),提示雷公藤红素可将细胞阻断于G1期。雷公藤红素可诱导LP-1细胞发生细胞凋亡,此效应具有剂量依赖性,雷公藤红素1μM作用于LP-1细胞48小时可诱导细胞凋亡百分率达到71.2%。雷公藤红素诱导LP-1细胞凋亡的过程中抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表达下调,雷公藤红素可引起LP-1细胞caspase-3酶原活化。雷公藤红素能剂量依赖性地抑制人血管内皮细胞对划痕损伤的修复能力,雷公藤红素1μM作用24小时即可引起划痕修复停滞,并引起部分血管内皮细胞死亡,在作用48小时后对人脐静脉内皮细胞表现出明显的杀伤活性。雷公藤红素以浓度依赖的方式抑制LPS刺激诱导的脐静脉血管内皮细胞的迁徙能力及侵袭力的增加,和LPS组相比划痕的直径在雷公藤红素浓度为0.025,0.05和0.1μM时分别增加72.9%,165.4%和246.2%。在雷公藤红素浓度为0.025-0.1μM时LPS依赖的细胞侵袭抑制率在45%-74%,雷公藤红素可抑制细胞培养上清液中VEGF水平变化,和LPS组对比,在浓度为0.025,0.05、0.1μM时分别下降了64.8%,84.4%和92.9%。雷公藤红素显著下调了LP-1骨髓瘤细胞株TLR4表达,雷公藤红素以浓度依赖的方式抑制NF-κBp65,IKKa和IκB-α蛋白表达水平的变化,雷公藤红素可阻断P65亚单位的入核。提示雷公藤红素可抑制LPS诱导的IKK/NF-kB信号通路的活化。结论：雷公藤红素可呈时间及剂量依赖性的抑制细胞增殖,雷公藤红素引起细胞增殖抑制通过诱导细胞周期阻滞在G1期,细胞周期调控蛋白P27水平上调在雷公藤红素引起的细胞周期阻滞过程中发挥重要作用,雷公藤红素可诱导人多发性骨髓瘤LP-1细胞凋亡,促进凋亡的过程中caspase-3酶原活化,抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin表达的下调。雷公藤红素可抑制细胞的侵袭及体外血管生成,这种作用可能与雷公藤红素抑制VEGF的分泌有关。雷公藤红素可引起NF-κBp65及IKKa表达的下调,并有效阻断NF-kappaBp65亚单位的入核,IκB-α的降解,下调TLR-4的表达,从而抑制LPS刺激引起的TLR-4活化,提示雷公藤红素可抑制NF-kappaB信号通路的活化,
【作者】倪海雯；
【导师】欧阳建；
【作者基本信息】南京中医药大学，中西结合临床，2013，博士
【关键词】雷公藤红素；多发性骨髓瘤细胞；细胞周期；细胞凋亡；血管生成；TLR-4；NF-κB；

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