周氏克金岩方有效单体协同抗非小细胞肺癌作用机制研究

【摘要】周氏克金岩方为国医大师周仲瑛教授临床经验总结的抗肺癌有效验方,由软坚散结、燥湿化痰、活血祛瘀、养阴益气等四类功效药物组成。课题组前期研究,经高通量筛选获得了有效细胞毒活性成分的多个靶点单体化合物。有待进行单体化合物抑制非小细胞肺癌(NSCLC)的分子机制的深入研究。目的：根据前期研究成果,有待于进一步探讨单体化合物的间的相互作用。拟定与四类功效药物相关的有效单体化合物,包括联苄(Bb)、麦冬皂苷B(OpB)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、异甘草素(ISL)、槲皮素(QC)、人参皂苷Rg3进行肺癌A549和H460细胞的体外抗肿瘤作用的研究,并确定单体组方的有效配比；以及对单体组合配伍的协同抗肿瘤机制的研究。方法：通过半数抑制率IC50的测定,确定单体抑制肺癌A549和H460细胞的生长增殖的贡献；应用L16(45)正交试验设计确定单体组方的保留成分；采用正交试验L9(34),从药物对细胞生长的抑制作用,对亚二倍体SubGl形成的影响,以及选择组方对肺癌A549和H460细胞的有效配比剂量,分析组方对细胞增殖周期的影响。通过膜磷脂重分布的流式细胞术(FCM)分析,以及高内涵分析(HCS)研究组方及单体对A549和H460细胞凋亡的协同作用。采用透射电镜(TEM)观察亚显微结构细胞凋亡对应的形态学改变。WesternBlot检测探讨组方对A549和H460细胞凋亡和死亡受体相关蛋白表达的调控作用的分子机制。结果：IC50结果表明,对A549和H460细胞,单体Bb无明显的生长抑制作用,弃除单体Bb；单体OpB、EGCG、QC均有很好的剂量依赖关系。单体ISL、Rg3呈现负抑制响应区间。经L16(45)正交试验组合EGCG-OpB-Rg3-QC-ISL对细胞生长的抑制实验,确定了组方的保留成分和剂量。单体EGCG浓度筛选值为50μM。单体OpB为10gM。单体Rg3建议25μM。单体QC为50μM。弃除药效相关性很差的单体ISL。从L9(34)正交试验设计,得到了理想组合OpB/EGCG/QC/Rg3的有效配比为OpB:EGCG:QC:Rg3=7.23:22.92:3.02:3.93(μg/ml)。IC50结果表明,对A549细胞24h、48hIC50值分别为17.70、5.69μg/ml;对H460细胞24h、48hIC50值分别为11.19、2.68μg/ml;该理想组合OpB/EGCG/QC/Rg3对两种细胞的生长抑制呈良好的剂量、时间依赖关系。从药物对细胞增殖周期的亚二倍体SubG1的影响,确定组方EGCG/OpB/QC/Rg3的配比。对A549细胞,组方EGCG/OpB/QC/Rg3-A549有效配伍为EGCG/OpB/QC/Rg3=50:10:10/5(μM),和值37.10μg/ml。对H460细胞,组方EGCG/OpB/QC/Rg3-H460有效配伍为EGCG/OpB/QC/Rg3=50:2:10/5(μM),和值31.31μg/ml。从正交试验中SubG1形成角度分析,单体EGCG是诱导肺癌A549和H460细胞晚期凋亡的主要因素。单体OpB对A549细胞的凋亡是协同因素,但对H460细胞有拮抗作用。单体QC和Rg3则在细胞周期的阻滞等环节辅佐因素EGCE对细胞周期的凋亡发挥作用。对细胞周期DNA倍体影响分析表明,对A459和H460细胞单体ISL主要导致SubG1期的减少,单体QC可使细胞周期阻滞在S期。单体Rg3使A549细胞周期阻滞在G2期,使H460细胞阻滞在G1。对诱导细胞凋亡的膜磷脂重分布分析表明,单药EGCG对两种细胞的(LR)AnnexinV(+)荧光值响应增高,可诱导细胞的早期凋亡。组方EGCG/OpB/QC/Rg3对A549细胞早期凋亡的响应显著大于单药和双药各组,且双药EGCG/OpB对早期凋亡的响应大于单药EGCG,经统计学分析有协同效应。但组方和双药组对H460细胞对早期凋亡的响应不显著,提示拮抗作用存在。对(UR)AnnexinV(+)/PI(+)荧光强度的响应分析,组方EGCG/OpB/QC/Rg3可诱导两种细胞的晚期凋亡和细胞坏死,对A549细胞的作用大于H460细胞。经过高内涵(HCS)多通道荧光扫描检测,在Hoechst33258通道结果显示,组方EGCG/OpB/QC/Rg3对A549细胞可诱导细胞的凋亡,呈剂量和时间正相关性；对H460细胞变化不显著。AnnexinV通道结果显示,组方EGCG/OpB/QC/Rg3对A549细胞可诱导细胞的早期凋亡呈剂量和时间依赖性；且诱导凋亡作用大于阳性药物4.0μg/ml顺铂。对H460细胞,只在中高剂量有明显的作用。PI通道结果表明,组方EGCG/OpB/QC/Rg3对A549和H460细胞在晚期凋亡与早期凋亡的作用增幅同步。transwell实验显示,组方EGCG/OpB/QC/Rg3对A549细胞侵袭能力的抑制呈正相关剂量依赖性。组方EGCG/OpB/QC/Rg3配伍中的单药对A549细胞侵袭力的抑制具有协同作用。经药物作用8h各实验组对H460细胞的transwell侵袭力未见很好的响应。表明A549细胞侵袭力大于H460细胞。通过透射电镜(TEM)观察组方及单药对细胞亚显微结构影响,对A549细胞结果表明,单药EGCG可诱导A549细胞的体积缩小、核固缩、染色质聚集的凋亡形态产生。单药OpB主要造成A549细胞器空泡变性或细胞自噬。单药QC对细胞的形态无明显改变。单药Rg3主要造成细胞的细胞器与细胞核的肿胀变性,使核膜受损,细胞变性坏死。组方EGCG/OpB/QC/Rg3作用下可观察到A549细胞的早期、晚期凋亡形态；同时伴有细胞器与细胞核肿胀,细胞膜受损,细胞崩解。表明药物的作用特征可协同表达在同一个细胞的镜像中。对H460细胞单药OpB可造成细胞器空泡变性或细胞自噬。单药QC可诱导细胞的内质网或细胞器的脂肪变性或粥样变性。单药EGCG、Rg3对细胞的形态无明显改变。组方EGCG/OpB/QC/Rg3可诱导H460细胞的早期凋亡形态的产生；可观察到细胞凋亡伴空泡变性或自噬、细胞器与细胞核肿胀,显示药物配对作用的共同特征。WesternBlot检测结果显示,组方EGCG/OpB/QC/Rg3.单药EGCG可上调促凋亡蛋白bax、caspase系列,下调抗凋亡蛋白bcl-2,诱导A549和H460细胞的凋亡。通过细胞凋亡的外源性途径的信号响应激活caspase8,启动caspase的级联反应。并引起内源性途径召集caspase-9及bax/bcl-2值的升高,诱导细胞的凋亡。单体OpB对单体EGCG诱导A549细胞凋亡蛋白的调控有协同作用,对H460细胞的凋亡蛋白有显著的负调控作用。因此,对不同克隆来源的非小细胞肺癌,单体配伍组方应采用相应剂量的不同配比方案。组方EGCG/OpB/QC/Rg3、单药EGCG对A549和H460细胞的死亡受体DcR3、DR5、Fas、TNFR1、TNFR2蛋白的表达均增高,进而可通过激活caspase8,启动caspase的级联反应,诱导细胞的凋亡。双药体系EGCG/OpB作用下,可使A549细胞的诱骗受体DcR3蛋白的表达减少,使DR5、Fas、TNFR1、TNFR2蛋白的表达增高。而EGCG/OpB可使H460细胞的诱骗受体DcR3蛋白的表达增高。因此,可竞争性的抑制其它功能性受体与配体的结合。结论：周氏克金岩方相关单体化合物表没食子儿茶素没食子酸酯、麦冬皂苷B、槲皮素、人参皂苷Rg3配伍的组方EGCG/OpB/QC/Rg3,在体外能有效抑制肺癌A549和H460细胞的生长增殖；形成对肺癌A549和H460细胞增殖周期的阻滞,诱导细胞凋亡的产生。单体OpB对单体EGCG抑制A549细胞的生长和促细胞凋亡有协同作用,对H460细胞有拮抗作用。组方EGCG/OpB/QC/Rg3对A549和H460细胞的外源性途径和内源性途径的凋亡相关蛋白的表达均有正向调控作用。单体OpB对H460细胞可以上调诱骗受体DcR3蛋白的表达,从而竞争性的抑制功能性受体与配体的结合,可能是对单体EGCG诱导的细胞凋亡产生拮抗作用的原因之一。因此,对非小细胞肺癌不同克隆来源的细胞体系,单体配伍组方应采用相应剂量的不同配比方案,才能起到更有效的抑制和调控非小细胞肺癌的作用。
【作者】周晶；
【导师】张旭；
【作者基本信息】南京中医药大学，中西医结合基础，2014，博士
【关键词】非小细胞肺癌；组方EGCG/OpB/QC/Rg3；生长抑制；侵袭；凋亡；调控机制；

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