山药致痒活性成分的分离纯化及其与Mrgprs家族相关性研究

山药致痒活性成分的分离纯化及其与Mrgprs家族相关性研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-09-03 分类:期刊论文 喜欢:3529
师大云端图书馆

【摘要】山药性味甘平,具有广泛的生理药效活性,常用于各种方剂及日常食疗保健。直接接触新鲜山药可以导致痒的发生,山药致痒的机理尚无研究报道。痒(itch)是一种不愉快的感觉,它可以引起搔抓欲望或者搔抓反射。痒常见于各种皮肤病,及一些系统性疾病。瘙痒严重影响人类日常生活,但目前针对各种痉痒的临床治疗相对困难,除了常规的抗组胺治疗外,尚无更有效的治疗方法。目前知道的致痒物质主要分为两类:一类是组胺类的致痒物质,包括组胺和可以刺激肥大细胞产生组胺的物质,其受体主要是组胺受体;另外一类是非组胺类的致痒物质:如氯喹、小肽BAM8-22,SLIGRL肽,菠萝蛋白酶、黑藜豆蛋白等,其受体主要是Mrgprs家族蛋白及PAR-2受体。直接接触新鲜山药汁引起的痒,并不会出现组胺致痒时的红肿瘢痕,因此推测其致痒物质是属于非组胺类致痒物质。Mrgprs能够被非组胺类的致痒物质如氯喹、小肽BAM8-22、SLIGRLβ-丙氨酸激活,导致痒觉的产生;一些瘙痒疾病如慢性瘙痒、接触性皮炎等也与Mrgprs关系密切。因此,Mrgprs在非组胺依赖的痒觉中可能扮演重要的角色。第一部分理论研究该部分对相关文献进行了整理及概括,较系统的综述了山药各种成分的分离纯化及药理药效研究,对痒的中西医研究情况进行了概述,并主要介绍了Mrgprs家族与痒的相关性。第二部分山药致痒活性成分的提取与Mrgprs家族相关性研究动物行为学研究表明,新鲜山药汁皮下注射可以引起野生型小鼠的抓挠反应,而皮下注射给予生理盐水、土豆匀浆,小鼠抓挠反应显著降低(P<0.05),而加热煮沸对山药致痒活性无影响,以上结果表明山药致痒引起的抓挠反应与溶剂、大分子淀粉颗粒、及大分子蛋白质无关。而在Mrgpr-cluster△-/-小鼠中,与同窝WT小鼠相比,新鲜山药汁引起的抓挠反应显著降低(P<0.05),表明山药致痒与Mrgprs家族相关。采用乙醇浸提法提取的山药致痒活性部位可以有效获得其活性致痒成分,行为学研究表明给予山药乙醇浸膏明显引起小鼠抓挠反应。将获得的乙醇浸膏经过氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分步萃取,通过动物行为学考察山药致痒的活性部位,发现乙醇提取后沉淀部分不能引起动物痒觉,推测可能不是多糖物质起作用,而萃取得到的氯仿相、乙酸乙酯相也没有表现出较好的致痒活性,随着萃取溶剂极性进一步加大,极性较高的正丁醇萃取相表现出了一定致痒活性,但山药致痒活性仍然以萃取残余水层致痒活性最高。以上结果表明山药致痒,引起动物抓挠反应可能是一类水溶性的、极性较高的化合物在起作用。第三部分山药致痒活性成分的分离纯化及结构鉴定采用AKTApurifier全自动液相色谱系统,以Sephadex-G50凝胶柱分离纯化山药乙醇浸膏,获得峰1(fraction-1)和峰2(fraction-2)。采用AKTApurifier全自动液相色谱系统,以MonoQ5/50阴离子交换柱分离fraction-1,获得峰型单一对称的峰Ⅰ(fraction-Ⅰ).峰Ⅱ(fraction-Ⅱ)和峰Ⅲ(fraction-Ⅲ).采用Waters-2695-2996全自动高效液相色谱系统,以ThermoHypersilBDSC18色谱柱分离峰Ⅰ(fraction-Ⅰ),洗脱体系为甲醇-水(各相均含0.1%TFA),获得峰型单一对称的峰Ⅰ-1(fraction-Ⅰ-1)、峰Ⅰ-2(fraction-Ⅰ-2)和峰Ⅰ-3(fraction-Ⅰ-3)。采用悬滴法进一步分离纯化fraction-I-2,获得纯度较高的化合物晶体。采用Agilent公司SuperNova双波长单晶衍射仪,获得晶体结构数据,进行解析,确定该晶体为单斜晶系,分子量为158.13,分子式为C4H6N4O3,暂命名为NJUTCM-01。以上结果表明,采用葡聚糖凝胶色谱法、离子交换色谱法、HPLC色谱法、结晶法可以有效的分离纯化山药中致痒活性成分,所获得的晶体纯度较高,采用单晶衍射可以获得山药中致痒活性成分的晶体学参数,分子量为158.13,分子式为C4H6N4O3,根据文献暂命名为NJUTCM-01。第四部分山药致痒活性成分的活性鉴定及其致痒分子机制的初步研究将葡聚糖凝胶Sephadex-G50柱分离纯化出的fraction-1和fraction-2进行动物行为学试验,结果显示,与溶剂对照组相比,葡聚糖凝胶分离获得的fraction-1与fraction-2可以引起动物抓挠反应(P<0.05),fraction-1内可以引起显著的抓挠反应显著高于同等剂量的fraction-2(P<0.05)。将离子交换分离fraction-1获得的fraction-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ,采用原代细胞培养方法获得WT小鼠DRG神经元细胞,以Fura-2孵育40min后,应用钙成像的方法考察致痒物质的细胞活性,通过观察细胞亮度及细胞反应数目来确定反应活性。结果表明,fraction-Ⅰ活性最高,其次是fraction-Ⅲ,而fraction-Ⅱ几乎无活性。将C18反相柱分离fraction-Ⅰ获得的fraction-Ⅰ-1、fraction-I-2及fraction-Ⅰ-3,应用钙成像的方法考察致痒物质的细胞活性,通过观察细胞亮度及细胞反应数目来确定反应活性,统计结果表明fraction-Ⅰ-2活性最高,而fraction-Ⅰ-1及fraction-Ⅰ-3活性很弱或无活性。以结晶法分离纯化fraction-Ⅰ-2,采用钙成像的方法考察致痒物质的细胞活性,通过观察细胞亮度及细胞内钙离子随时间变化图确定反应活性,结果表明,给予晶体后,在短时间内即可引起DRG神经元细胞内钙离子内流达到峰值反应强度。将分离纯化确定结构的NJUTCM-01给予小鼠背部皮下注射,动物行为学结果显示,与溶剂对照组相比,NJUTCM-01可以引起动物抓挠反应;而给予WT小鼠及Mrgpr-clusterΔ-/-小鼠背部皮下注射。动物行为学结果显示,与WT组相比,Mrgpr-clusterΔ-/-小鼠中NJUTCM-01引起动物抓挠反应显著降低。根据之前预实验,原代培养获得WT小鼠的DRG神经元细胞,Fura-2孵育40min后,将NJUTCM-01给药用于钙成像实验。观察细胞亮度变化、细胞内钙离子浓度随时间变化图,并统计对NJUTCM-01刺激反应的细胞比例,结果表明,灌流给予NJUTCM-01后,在短时间内即可引起DRG神经元细胞内钙离子内流达到峰值反应强度,并随着灌流液持续灌流呈洗脱的趋势;通过统计细胞反应比例发现,有8%的DRG神经元细胞对NJUTCM-01有响应(n=458)。同样,电生理实验表明,膜片钳记录到的响应NJUTCM-01刺激的细胞属于小直径的感觉细胞神经元。原代培养获得WT、Gcamp小鼠的DRG神经元细胞,将NJUTCM-01、氯喹、组胺、薄荷醇、辣椒素采用灌流方式给药用于钙成像实验。观察细胞亮度变化、细胞内钙离子浓度随时间变化图,并统计上述药物刺激反应的细胞比例。结果表明,在给予MrgprA3与组胺受体各自的激动剂氯喹和组胺引起反应的部分细胞,同时也可以被NJUTCM-01激活。此外,对薄荷醇刺激有反应的神经元细胞中有24.5%也对NJUTCM-01有反应;而92%对NJUTCM-01刺激有反应的神经元也对辣椒素也有反应。第五部分结论(1)动物行为学研究表明,新鲜山药汁皮下注射可以引起野生型小鼠的抓挠反应,且与溶剂、大分子淀粉颗粒、及大分子蛋白质无关。(2)山药致痒与Mrgprs家族有关。(3)采用乙醇浸提法及溶剂萃取法可以有效获得山药活性致痒成分,山药致痒的活性成分可能是一类水溶性的、极性较高的化合物。(4)利用葡聚糖凝胶色谱法分离纯化山药乙醇提取浸膏,获得fraction-1和fraction-2;利用阴离子交换色谱法分离纯化离子交换获得的fraction-1,获得fraction-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ;利用HPLC反相色谱法分离纯化阴离子交换获得的fraction-Ⅰ,获得fraction-Ⅰ-1、fraction-I-2和fraction-Ⅰ-3;利用悬滴法对fraction-Ⅰ-2进行结晶纯化,获得纯度较高的化合物晶体;利用X-射线单晶衍射仪对该化合物的晶体结构数据进行收集,确定分子量为158.13,分子式为C4H6N4O3,根据文献暂命名为NJUTCM-01.(5)采用葡聚糖凝胶、阴离子交换、HPLC-C18及悬滴法结晶分离山药乙醇提取物分别获得致痒成份,通过动物行为学及钙成像研究考察其活性,表明这些化合物都有较好的致痒活性。(6)山药中所含有的NJUTCM-01的确可以致痒,是山药致痒的主要因素,且与Mrgprs家族相关。(7)初步研究NJUTCM-01引起痒觉可能与Mrgprs受体有关,且TRPM8、TRPV1参与其反应。
【作者】简暾昱;
【导师】唐宗湘;
【作者基本信息】南京中医药大学,中西医结合基础,2014,博士
【关键词】山药;痒;Mrgprs;G蛋白耦联受体;

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